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RNA干扰VEGF对体外JAR细胞生长的影响 　　摘 要：利用pSUPER质粒作为载体，在人绒癌JAR细胞内成功的沉默了VEGF基因的表达，建立了稳定转染pSUPER-shVEGFl，pSUPER-shVEGF2干扰质粒的JAR细胞株．随后利用RT-PCR证实了在JAR细胞株中，VEGF基因的表达被抑制，显微观察及流式细胞学检测转染后细胞株克隆生长情况显示体外培养条件下VEGF基因受抑后JAR细胞生长周期无发生变化，提示VEGF在体外可能对JAR细胞增殖无直接作用。 　　关键词：RNA干扰；血管内皮生长因子；JAR细胞；pSUPER载体 　　中图分类号：R34 　　文献标识码：A 　　文章编号：1007-7847(2007)0l－0072-06 　　 　　血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor.VEGF)是一种作用于血管内皮细胞的多功能细胞因子，具有强有力的血管生成与新生作用，与肿瘤生长密切相关RNA干扰(RNAinterference.RNAi)是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA(double-strandedRNA.dsRNA)时特异性阻断该基因表达的现象，RNAi技术能使人类快速了解生物体内某基因的功能，同时它的基因特异阻断特性为基因治疗提供了有益的探索，本研究利用RNA干扰技术，抑制或沉默来自于绒癌滋养细胞JAR细胞株的VEGF的表达，研究体外VEGF对于JAR细胞生长的影响，旨在探讨VEGF在恶性肿瘤中的作用机制，为恶性肿瘤的病理机制及治疗提供线索． 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1.1 主要材料 　　1.1.1 人绒癌JAR细胞株 　　购自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库，常规培养于含10％小牛血清的RPMI-1640培养液中。 　　1.1.2 主要试剂 　　逆转录试剂盒购自Promega公司；RPMI-1640培养基，pUC Mix marker为上海生工生物工程技术服务有限公司产品；LipofectamineTM2000脂质体和Fugene6转染试剂购自Invitrogen公司MiniBESTPlasmid Purification Kit，HindⅢ、EcoR I限制性内切酶，Taq DNA聚合酶购自TaKaBa公司；大肠杆菌DH5α，JM109由中南大学肿瘤研究所惠赠；pMD18-T载体购自TaKaBa公司；pSUPER.retro质粒，即pSUPER逆转录病毒载体由OligoEngine公司生产，带有HI-RNA启动子序列。HindⅢ及EcoR I酶切位点，具有氨苄和嘌呤霉素抗性，如图1。 　　 　　 　　1.2 方法 　　1.2.1 VEGF寡核苷酸序列的设计 　　根据文献查询及实验目的，参照其他成功者的经验，上游引物应用5′端通用引物，携有HI启动子起始区及EcoR I酶切位点；为确保RNA干扰成功，下游引物设计两对VEGF特异性序列，分别称为Vla、Vlb及V2a、V2b，为19nt核苷酸的正向插入序列及反向互补序列，中间被9个碱基(100p区)分开，克隆后可组成短发夹结构，根据pSUPE.retro载体结构，下游引物携有HI启动子的末端区序列及HindⅢ酶切位点接头，中间插入BglⅡ的酶切位点；短发夹VEGF(short hair-pin VEGF，shVEGF)目的序列的5′端第一个碱基设计为G，启动子下游的酶切位点下方紧连一个C，使插入片段和启动子有一定空间间隔，以确保转录的发生． 　　1.2.2 RNA干扰质粒的构建 　　1.2.2.1 PCR 　　分别以Primer 1和Primer Vla及Primer 1和Primer V2a为上下游引物，以pSUPER．retro为模板进行第一轮PCR．将第一轮PCR产物稀释100倍，分别取1μL作为模板，再分别以Primer 1和Primer Vlb及Primer V2b为引物进行第二轮PCR.HI Promoter区218 bp，第一轮PCR产物252bp，第二轮PCR产物298 bp.PCR的反应体系：10 x reaction buffer 2μL，模板DNA 1μL，上游引物(10μmol/L)0.4μL，下游引物(10μmol/L)0.4μL，dNTPs(2mmol/L)0.4μL，Taq酶1U，加ddH2O至20μL．反应条件：94℃预变性30s、62℃退火30s、72℃延伸40 s，30个循环，72℃延伸10min，第一轮PCR产物扩增出HindⅢ酶切位点，H1启动子区域、BgtⅡ酶切位点、VEGF的正义链序列及loop区；第二轮PCR，扩增出具有H1启动子区域并带针对VEGF的发夹RNAi片段产物，且在它们之间有