MicroRNA研究策略 MicroRNA转化 医学研究与SCI论文策略.ppt

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MicroRNA研究策略 MicroRNA转化 医学研究与SCI论文策略

赢润生物 2012年07月26日 讲座主线 MicroRNA简介 MicroRNA的检测 MicroRNA的过表达 如何下调MicroRNA MicroRNA靶基因验证实验 MicroRNA相关SCI论文实例 一. MicroRNA简介 MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约20-24个核苷 酸的小RNA。其在细胞内具有多种重要的调节作用。 网状作用模式:每个miRNA可以有多个靶基因,而几个 miRNAs也可以调节同一个基因。 据推测,miRNA调节着人类三分之一的基因。 miRNA数据库: 两个概念: pri-miRNA ? pre-miRNA ? Mature miRNA miRNA的种子序列(seedsequence): 成熟miRNA 的5’端的第2~8位核苷酸与 靶mRNA 3’端的非翻译区(UTR)部分 序列的结合很重要,被称为种子序列。 二. MicroRNA的检测 MicroRNA芯片 优点:高通量 缺点:成本高; 难区分前体miRNA和成熟 miRNA Northern blot 优点:能比较直观的反映miRNA的表达量高低 缺点:步骤复杂; 难区分前体miRNA和成熟 miRNA miRNA qPCR检测(Real-time PCR) 优点:可区分前体miRNA和成熟 miRNA; 检测灵敏度高; 高特异性; 成本较低 难点:Mature miRNA很短,如何检测? 解决方法:加长序列 miRNA qPCR检测:Stem-loop法 miRNA qPCR检测:Poly A加尾法 Stem-loop法 优点:特异性高 缺点:每做一次RT,只能检测一个miRNA 代表厂家:ABI、Ambion Poly A加尾法 优点:通用性高;一次RT可以检测多个miRNA 缺点:特异性稍差 代表厂家:Qiagen YRBIOTM miRNA qPCR Detection Kit 相关实验数据:良好的熔解曲线 miRNA qPCR检测实例 miRNA qPCR检测实例 三. MicroRNA的过表达 pri-miRNA ? pre-miRNA ? Mature miRNA pri-miRNA结构: CMVp---EGFP---pri-miRNA---Poly A pre-miRNA结构: hU6p---pre-miRNA---TTTTTT 人工pri-miRNA结构: CMVp---EGFP---mir30左臂---pre-miRNA---mir30右臂---Poly A pYr-pri-miRNA范例 pYr-pri-miRNA范例 pYr-pri-miRNA范例 pYr-pri-miRNA范例 pYr-pri-miRNA范例 pYr-pri-miRNA范例 人工pri-miRNA范例 Tips:pri-miRNA过表达,miRNA能够提升多少? (1)如果目的细胞中已有miRNA的高表达: 大约提升2~5倍。 (2)如果目的细胞中目的miRNA低表达或无表达: 大约能提升50~1000倍。 四. 如何下调MicroRNA 如何下调miRNA,实现loss-of-function研究? (1)化学合成的miRNA antisens oligo。 优点:比较经济;合成时间较短 缺点:作用时间短;转染效率受限制 (2)载体形式的miRNA inhibitor。 优点:可长期稳定作用;转染效率高 缺点:构建周期较长 如何构建载体形式的miRNA inhibitor 方法一:miRNA sponge miRNA sponge作用效果 如何构建载体形式的miRNA inhibitor 方法二:miRNA Decoy(TuD RNAs) miRNA Decoy作用效果 五. MicroRNA靶基因验证实验 检测方法 (1)miRNA靶标载体、 内参荧光素酶载体、 miRNA mimics或miRNA过表达载体 共转染。 (2)带有内参荧光素酶的miRNA靶标载体、 miRNA mimics或miRNA过表达载体 共转染。 然后做双荧光素酶检测实验。 进一步确定目的miRNA和靶基因之间的关系 (1)构建含突变靶位点的miRNA靶标载体。 其它步骤同前。 (2)靶基因表达检测: 目的miRNA

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