定量PCR技术简介聚合酶链反应-中国试剂网.PDFVIP

中国试剂网 3.12.7.22 定量 PCR 技术简介 聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR ）是微量核酸扩增的有效工具，由 于其灵敏、特异、快速等优点，在医学上已广泛应用与病毒、细菌病原体及遗传 病、肿瘤的早期诊断。随着 PCR 技术的发展，特别是病毒或肿瘤的治疗监测、 疾病的诊断、机体基因表达调控方面，不仅需要检测其存在是否；而且还需要得 知扩增前标本中的模板的数量，因而必须对PCR 进行定量检测，即定量PCR 技 术，本文将对定量PCR 的定量原理、技术类型以及相关进展方面综述如下： 一、 定量PCR 的基本原理： 在PCR 实验条件下（Mg++ 、缓冲液、Taq 酶、dNTP、引物、模板），经变性→ 退火→延伸的一个循环，引物在退火阶段与相应的模板结合，在延伸阶段进行复 制，此时产物为：Yn=Yn-1×(1+Ev) ,Yn:n 个PCR 循环后PCR 产物的分子数；Yn-1: 为n-1 个热循环后PCR 产物的分子数；Ev:为扩增效率,0≤Ev≤1；若n 个热循环中 其Ev 是一致的话，经n 个循环后的扩增产物的分子数（Y ）和反应物中原始分 子数（X ）之间关系，可描述为：Y=x×(1+ Ev)n 。 1. 终点法定量原理： 在最佳实验、循环次数n 一定、Ev 相同的前提下，根据扩增产物的量可以计数 出反应物中原始分子数，若核酸提取效率相同（与标准品），进而计算出标本中 靶分子的准确含量，即： lnx=lnY-n×ln(1+Ev)=lnY - b (b 为常数) 2. 实时检测法定量原理： 在最佳实验、相同 Ev 以及相同扩增产物的情况下，反应物中原始分子数（X ） 与其所需要的扩增循环次数（n ）成反比，若核酸提取效率相同（与标准品），进 而计算出标本中靶分子的准确含量，即： LgX=LgY–n×Lg(1+Ev)=b - n×a (a 、b 为常数)3. 扩增效率（Ev ）的影响因素： 以上所述的定量原理均假定反应体系中扩增效率是不变，但是，实际上，Ev 在 不同的扩增管之间和同一扩增管的不同循环次数之间是不同，如何控制及解决 Ev 的变异以及标本制备的可靠性是PCR 定量的可靠性所在，也是定量PCR 的 发展方向，那么，Ev 的影响因素有： a. 引物和靶序列的结合能力（G+C%及突变），扩增产物的长度，G+C 含量。 中国试剂网 3.12.7.22 b. 模板的含量、DNA 聚合酶、反应液成分变化。 c. 不同临床标本间DNA 聚合酶抑制物的存在情况。 d. 循环扩增仪上不同位置的差异。 二、 定量PCR 方法的分类： 目前对标本的靶DNA 或基因的相对或绝对含量是不同样品的PCR 产量检测而推 算出来，根据标本中是否加入内标物，将分成以下两种： （一）外标法定量PCR ： 一个已知含量的标准品（通常用质粒）经一系列的稀释后与待检标本一起进行扩 增，制作 PCR 扩增产物和靶核酸含量的标准曲线，根据待检标本的扩增产物量 即可推算出靶核酸的绝对含量；上述已提及不同标本间的扩增效率（Ev ）的差 异，对样本间PCR 产量作比较会产生很不准确的结果；以外还应考虑“平台效应” 对结果的影响，因为“平台期”PCR 产物量并不受初时模板量的影响；导致结果的 准确性和重复性差，因此采用外标法应该注意： a、 注意标准化操作，优化最佳实验条件，减少标本间Ev 的差异导致对结果的 影响。 b 、 标准品的稀释因存在随机分布而导致结果的不准确。 c、 注意“平台效应”对实验结果的影响。特别是后面提及的终点法检测 PCR 产 物的方法中。 d、 由PCR 方法很灵敏，特别RT-PCR 方法，没有内标存在的情况下，标本的 污染而对实验结果产生很大的影响。 e、 标本处理对结果的影响。 （二）内标法定量PCR ： 由于上述提及的外标法存在不同标本间的 Ev 差异和标本的提取（特别是 RT-PCR ）的微小变化都将导致扩增产物的巨大差异。为了清除此种影响，国内 外都推重采用内标法。内标法是用PCR