基因工程制药思考题补充版.docVIP

一、基因工程药物上游表达系统重点 1、大肠杆菌表达系统与酵母表达系统的异同(指出至少四点)。 相同点：易操作、繁殖快、成本低廉、易于工业化生产 不同点： 1.mRNA在真核中有PolyA尾巴，而在大肠杆菌中没有 2.大肠杆菌表达系统转录信号与酵母表达系统不同，与核糖体的结合位点不同。 3．在大肠杆菌中表达不存在翻译后修饰作用，故对蛋白质产物不能糖基化，而且大多数无法正确折叠；酵母菌具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统。 4.大肠杆菌表达系统由于分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物必须在下游处理过程中经过变性和复性处理才能恢复其生物活性，且对于大肠杆菌来说，外源基因及其表达的蛋白都是外来物，对其有降解的趋势；酵母菌具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低、包涵体变性复性等问题。 5.大肠杆菌中的表达不存在信号肽，故产品多为胞内产物，提取时需破碎细胞，此时细胞质内其他蛋白也释放出来，因而造成提取困难；酵母菌能将外源基因表达产物分泌至培养基。。 2、动物细胞表达系统与昆虫表达系统的异同(指出至少四点) 相同点： 1．动物细胞表达系统能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能,昆虫表达系统也可进行翻译后加工修饰。 2．哺乳动物细胞表达载体的必要元件包括：一个高活性的启动子、转录终止序列和一个有效的mRNA翻译信号，而利用重组杆状病毒在昆虫细胞体系中表达外源蛋白由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的外源蛋白质，在活性方面远胜于昆虫细胞表达系统，更接近于天然蛋白质27-28℃，不需要CO2，这与哺乳动物细胞的培养是不同的。 3．动物细胞除少数悬浮培养细胞外，大多数正常的二倍体细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制或密度抑制现象；昆虫细胞既可以贴壁生长，又可以悬浮生长。 4.与哺乳动物细胞的生长不同，昆虫细胞产生乳酸这一动物细胞主要代谢副产物的量很低，同时对另一副产物—氨的耐受力较好，这意味着昆虫细胞的培养较哺乳动物细胞容易，因此昆虫细胞的培养多采用补料分批培养而不是灌注培养。 3、从工业化生产的角度，分析大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统和动物细胞表达系统的优缺点。 大肠杆菌（E.coLi）表达体系 优点： 1、与其它生物相比，基因简单，遗传背景清楚 2、繁殖速度快，平均20min一代 3、培养方法简单，成本低 4、相对其它生物对人体而言，安全性高 5、表达载体多，构建方便 缺点： 1、由于基因结构上的差别，会出现密码子偏好 2、转录信号与真核不同，与核糖体的结合位点不同，不通用，即SD序列。 3. 表达的蛋白缺乏翻译后修饰，如没有糖基；而且大多数无法正确折叠 4. mRNA在真核中有PolyA尾巴，而在大肠杆菌中没有 5. 只能表达cDNA，而内含子的作用没有体现 6. 对于大肠杆菌来说，外源基因及其表达的蛋白都是外来物，对其有降解的趋势 酵母表达系统 优点： 1、全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便 2、具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉 3、能将外源基因表达产物分泌至培养基 4、不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的基因工程受体系统 5、酵母菌是最简单的真核模式生物 缺点： 酵母表达系统也有其局限性。由于表达的外源蛋白的聚合体存在而影响产率；由于信号肽加工不完全、内部降解等因素造成表达产物结构上有差异的现象，即表达产物不均一现象，为酵母表达基因工程产物的纯化和工业化生产带来了困难。具有同大多数高等真核生物相似的翻译后修饰加工以及转移外源蛋白的能力。利用重组杆状病毒在昆虫细胞体系中表达外源蛋白是目前较为流行的表达方式，其表达的蛋白水平高达1~500mg/L，但受到诸多因素的限制和影响，如培养基质量、供氧情况、保证对数生长等杆状病毒系统的主要点包括重组蛋白具有完整的生物学功能，如蛋白的正确折叠、二硫键的搭配；蛋白翻译后的加工修饰；表达水平高，可达总蛋白量的50%；可容纳大分子的插入片段；能同时表达多个基因。主要缺点是外源蛋白表达处于极晚期病毒启动子的调控之下，这时由于病毒感染，细胞开始死亡哺乳动物表达系统在蛋白的起始信号、加工、分泌、糖基化方面具有独特优势，适合表达完整的大分子蛋白。由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的外源蛋白质，在活性方面远胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统，更接近于天然蛋白质，但构成复杂、操作技术要求高、表达产量不大、产率低，生产成本高且有时会导致病毒感染等是该表达系统的不足之处。SD序列，而且SD序列与起始密码子ATG之间要有合适地距离； 3、在克隆基因与启动子之间有正确的阅读框架； 4、外源基因下游应加入不依赖于ρ因