研究生课件 第五讲植物转基因方法.pptVIP

第五讲 农杆菌介导的植物转基 因方法 植物生物技术 Protoplast transformation of transgenic Valencia sweet orange plants with GFP by PEG-mediation 一、农杆菌介导的（Agrobacterium-mediated ）转基因机理 天然的植物遗传工程 原因：土壤农杆菌中Ti质粒上一段DNA（T-DNA，transfer DNA，含有细胞分裂素和生长素合成酶基因)转到了植物细胞基因组中，引起植物细胞旺盛分裂。 （一）Ti质粒的结构 Ti质粒大约在160-240kb之间。其中T-DNA大约在15kb-30kb。Vir基因区在36kb左右。除此之外，Ti质粒上还存在Con区（region encoding conjugation)和ori区（origin of replication)。 根据冠瘿碱不同， Ti plasmids可以为几种： 1)胭脂碱型（Nopaline plasmids）: 带有在 植物中合成胭脂碱的基因和在 细菌中代谢、利用胭脂碱的基因。形成的肿瘤可以分化出不定芽。 Nos启动子， Nos终止子。 2)章鱼碱（Octopine plasmids）:带有在 植物中合成章鱼碱的基因和在 细菌中代谢、利用章鱼碱的基因。形成的肿瘤不能分化，成为愈伤组织。 3)农杆碱型（Agropine plasmids）:带有在 植物中合成农杆碱的基因和在 细菌中代谢、利用农杆碱的基因。形成的肿瘤不分化出，然后死亡。 4) 发根型（Ri plasmids）: 诱导毛状根或者肿瘤。 2. Vir (virulent) genes（毒性基因区，致病基因区 About 30 kb; virA,B,C,D,E,F,G (A-E are operons with multiple ORFs)； 受到受伤植物细胞释放的Acetosyringone (AS，乙酰丁香酮) 激活； 把Ti-质粒或者Ri-质粒的T-DNA 转移到植物细胞基因组中（转基因）。 virA - transports AS into bacterium, activates virG； virG - promotes transcription of other vir genes； virD2- endonuclease that cuts T-DNA at the borders but only on one strand; attaches to the 5‘ end of the SS of T-DNA； virE2- DNA-binding protein, binds SS of T- DNA； virD2 virE2 also help T-DNA get to nucleus in plant cell, they have NLSs(核定位信号)； virB - 11 ORFs, helps DNA-protein complex get through cell membranes。 （二）T-DNA的整合机制 T-DNA的详细整合机制尚不完全清楚，明确的： 农杆菌染色体上的基因（chvA, chvB, pscA等）决定与植物细胞的附着； 植物损伤部位分泌出酚类物质乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮，这些酚类物质可以诱导Ti质粒上Vir（Virulence region)基因的表达； Vir区编码的基因产物分别在LB和RB的第三个碱基和第四个碱基之间产生缺口，形成单链T-DNA，并将其运到植物细胞核中，整合到核基因组中。由特异性内切酶完成。T-DNA的LB和RB在整合中的作用是不对称的，RB顺序与整合有关，而LB无关。 T-DNA的整合可以是单拷贝的，也可以是多拷贝的，成串联形式排列。 二、植物基因表达载体 天然的Ti质粒不能作为表达载体使用：　　a. 被转化的植物细胞产生大量的生长素和细胞分裂素，导致肿瘤的形成，阻止了细胞再生长为整株植物，因此，必须除去生长素和分裂素基因。　　b. 冠瘿碱的合成与T-DNA的转化无关，而且可能会影响植物细胞生长，因为冠瘿碱合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，因此必须去除冠瘿碱合成基因（tmt） 　　c. Ti质粒约为200kb，重组操作非常困难，也很难找到单一的酶切位点。  d. Ti质粒不能在大肠杆菌中复制，为了使重组质粒DNA的大量扩增，须添加入大肠杆菌复制子。 植物细胞中一般不存在质粒，为利用农杆菌的Ti质粒，发展了共整合系统和双元载体系统，避免了在大的Ti质粒上进行分子重组操作的困难。 1. 植物细胞转化的共整合系统　　T-DNA克