实验5-芽胞染色.pptVIP

微生物学教研室 郭棵棵 （验证性试验） 录像：肠杆菌科 上次课结果观察 操作：（1）肠道致病菌的分离鉴定（二） —— 接种克氏双糖铁培养基 （2）枯草芽胞杆菌的芽胞染色 材料：（1）克氏双糖铁培养基 1支/人 （2）枯草芽胞杆菌 （3）染液（石碳酸复红，美兰等） 实验内容 [教学目标] 了解： 肠道杆菌的分离鉴定 枯草芽胞杆菌芽胞的形成条件及生物学意义 掌握： 1. 肠道致病菌糖发酵的结果鉴别 2. 鉴别培养基上菌落的特点 3. 掌握枯草芽胞杆菌芽胞染色的方法 化脓性球菌分离鉴定 上次课结果观察 脓汁 甘露醇发酵实验 触酶实验 血浆凝固酶实验 血清肉汤 沉淀生长 葡萄状排列 （大小、溶血、色素） （分类、形态、排列） 革兰染色 链状排列 血平板 菌落观察 1、肠道菌分离鉴定的操作步骤（续） 粪便 接种 三线法 S.S平板 37℃ 培养24h 选可疑菌落 接种 克氏双糖铁培养基 肠道菌分离鉴定（二） 操作一 2、S.S平板（复习） 组成及作用: 胆盐、煌绿、枸橼酸钠等：能抑制杂菌生长 乳糖：可被非致病性肠道菌分解产酸，但致病 性肠道菌不能分解之。 中性红指示剂：酸红碱黄 硫代硫酸钠、枸橼酸铁：鉴别硫化氢产生 形成粉红色菌落者为非致病性肠道菌 形成无色或浅黄色菌落者疑为致病性肠道菌 结果判断: S.S平板培养结果 葡萄糖、乳糖：可被细菌分解产酸产气蛋白胨：细菌分解可产生H2S硫酸亚铁：与H2S结合形成FeS黑色沉淀酚红指示剂: pH范围6.8-8.4(酸黄碱红) 3、克氏双糖铁培养基 组成及作用 仅分解葡萄糖时，产生的酸少，随着培养时间延长，在有氧条件下，会被细菌分解产生的碱性物质中和，而使斜面维持原有的红色；而底层则因酸性物质的存在使酚红指示剂由红色变为黄色。 克氏双糖铁培养基培养基中乳糖与葡萄糖的比例为10∶1。 对乳糖、葡萄糖的发酵能力 克氏双糖培养基中乳糖含量大，细菌分解后产酸多，故发酵乳糖不仅能使培养基底层变成黄色，斜面也会由红变黄。因此，通常以克氏双糖铁培养基的斜面部分代表乳糖，底层部分代表葡萄糖。 当细菌分解糖类产气时，培养基中还会有气泡或裂隙出现。 克氏双糖培养基糖发酵结果判断 早期 18-24 h B A C 培养基中含有的硫酸亚铁，可用于检查细菌能否分解蛋白胨中含硫氨基酸生成H2S，如果有H2S产生，则能与硫酸亚铁反应，生成黑色的硫化亚铁沉淀，培养基中出现黑色物质。 对含硫氨基酸的分解能力 斜面 —— 蛇形划线 高层 —— 穿刺接种 用接种针从S.S平板上挑取不发酵乳糖的可疑菌落，先在斜面上自下而上划一直线，而后将接种针插入高层，抽出接种针后立即在斜面部位自下而上做蛇形划线，接种完后放于37℃孵箱18～24小时后观察结果。 克氏双糖铁培养基的接种方法： 枯草芽胞杆菌芽胞染色 枯草芽胞杆菌 （Bacillus subtilis） 枯草芽胞杆菌，革兰阳性杆菌。无荚膜；周鞭毛，能运动；芽胞0.6～1.4微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽胞形成后菌体不膨大。 菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色；在液体培养基中生长时形成菌膜，需氧菌。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖得名。 操作二 （枯草芽胞杆菌菌落） 概念：某些细菌（多为革兰阳性杆菌）在一定生长阶段或环境条件下，细胞正常代谢、分裂停止，胞质浓缩，在细胞内形成一个圆形、椭圆形或圆柱形，对不良环境有较强抵抗能力的特殊结构。 细菌芽胞（Spore) 芽胞的特点： 对不良环境有很强的抵抗能力，在一定条件下可保持活力数年甚至数十年之久； 耐高温： 枯草杆菌的芽胞在沸水中可存活1小时； 破伤风杆菌的芽胞可在沸水中存活3小时； 肉毒杆菌的芽胞可在沸水中存活6小时，即使在180℃干燥箱中仍可存活10分钟。 细菌休眠体，不能繁殖，条件适宜时能重新萌发； 芽胞可作为培养基灭菌彻底与否的检验依据。 芽胞染色的原理： 细菌的芽胞和菌体对染料具有不同亲合力，用不同染料染色可使芽胞和菌体呈现不同的颜色。 芽胞壁厚、透性低，着色、脱色均较困难。当用弱碱性染料初染时，加热处理可使菌体和芽胞均着上颜色；进入菌体的染料可经95%乙醇脱色，而进入芽胞的染料则难以透出；复染后芽胞和菌体呈现出不同颜色，易于区分。 石碳酸复红（加热3-5 min） 芽胞染色 95%乙醇（0.5-1 min ）