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蛋白晶体学 Protein Crystallography Protein Crystallography 整理：林钰棋、徐国栋、林琦彬 1. 前言 结构分子生物学是研究生物分子结构与其生物功能机制间的关系进而改造生物分子 ( 如蛋白质工程 ) 或开发其抑制药物 ( 药物设计 ) 的一门科学 ( 参 1 ) 。主要内容即研究生物大分子的三维结构和功能。也就是说，结构分子生物学是以生物大分子结构及其运动的测定为基础来阐明生命现象的科学。由于研究方法的不断成熟和改进，配合分子生物学提供的研究基础、途径和对象不断拓展，近年来此一领域的研究进展十分迅速，使得人们对那些重要生物大分子 ( 如核酸、蛋白质、糖和脂类等 ) 的结构功能关系之了解有了许多突破。 完整、精确地测定生物大分子三维结构的主要研究对象包括核酸、蛋白质、寡糖、脂类及它们之间的复合物。目前采用的研究方法主要有： X 射线单晶绕射分析 ( 亦称晶体结构分析 ) 、二维和多维核磁共振 ( NMR ) 技术、电子绕射分析 ( 电子结晶学 ) 、扫描隧道显微技术 ( STM ) 和原子力显微技术 ( AFM ) 以及计算机和资料分析技术等。 由于蛋白质为生命体构成的主要物质，亦是生命活动的主要承担者 ( 参 5 ) ，研究蛋白质分子的三维结构和功能对生物制药等蛋白质工程具有十分重要的意义。蛋白质晶体学研究便是利用 X 射线单晶绕射分析 ( 亦称晶体结构分析 ) 技术来了解蛋白质的三维结构。 其中过程涵盖了蛋白质样品制成、结晶、 X 射线绕射、结构解析及功能解释等方面内容，涉及生物物理和生物化学、结构化学、凝聚物理、物理化学和计算机等多学科知识，是典型的交叉学科。蕴含着丰富的未知规律，期待人们去探索和研究。 蛋白质晶体结构分析首先要将蛋白质高度纯化，培养成晶体，再利用 X 射线绕射法分析蛋白质晶体中每个基团和原子的空间定位。 进行步骤大纲如下 ( 参 4 ) ： 1. 1. ????? 制作蛋白质晶体与重金属衍生物 2. 2. ????? 绕射数据的收集 3. 3. ????? 数据计算 4. 4. ????? 解决相位问题 5. 5. ????? 获得电子密度图 6. 6. ????? 大分子模型建立 2. 蛋白質純化 ?   欲获得晶体，蛋白质分子的纯度和均一性是能否获得完美结晶的关键之一 ( 参 2 ) 。 重组 DNA 技术在这方面是一个很重要的帮助。 由蛋白表现质体所获得的蛋白质能够快速获得纯化，并且只需很少的纯化步骤就能得到均一的样品。 一般来说，一个蛋白质样品想要使其能结晶，至少需要 95% 的均一性，且尽可能地减少溶液中的化学物。 此外，要纯化蛋白质之前，通常要先了解以下蛋白质的特性： 物理特性 1. 1. ????? 蛋白质是否会凝集 2. 2. ????? 蛋白质是否会吸附于纯化管柱或膜上 3. 3. ????? 蛋白质经过分离后保持稳定的时间 化学特性 1. 1. ????? 蛋白质是否有双硫键形成 2. 2. ????? 蛋白质是否会被金属离子活化 蛋白质特性 1. 1. ????? 蛋白质如何保持稳定状态 2. 2. ????? 蛋白质所适合的温度 3. 3. ????? 蛋白质所适合的 pH 值 4. 4. ????? 蛋白质所需的添加物 ( 如抑制蛋白酶的 EDTA) 5. 5. ??????造成蛋白质不稳定的化学成分 3. 蛋白质结晶原理 要利用 X 射线单晶绕射分析技术来了解蛋白质的三维结构，首先就是要获得蛋白质晶体。 因此要迫使分子结晶的动力和动力学体系相同，即是使自由能达到最小，此时吸引作用 -- 电的、空间的、疏水的、亲水的作用达到最大，而分散或排斥力减至最小。对于生物大分子，如蛋白质，通常它们达到完全溶剂化时，才达到自由能最小。 在浓溶液中，没有足够的水维持完全溶剂化（或说使大分子相互之间隔开），大分子因此沉淀或结晶。 聚集作用过快，往往产生非晶态沉淀，一般来说，应使不完全溶剂化过程尽量减慢，让分子有机会把自己排列到晶格中 ( 如图 1 ；参 15 ) 。大分子会因其形状、多价特性和物理性质，及溶液浓度、 pH 、温度等因素影响下，会有不同的最小溶解度。 因此，要使大分子结晶的方法，即让溶液体系非常缓慢趋向溶解度最小，进而达成过饱和状态 ( 参 3 ) 。 圖 1. 蛋白質晶体由成千上萬的相同蛋白質所組成 由于球状蛋白分子量较大，而且表面分子结构较不稳定，欲获得排列有序的晶体是比较困难的。所形成的晶体不会是完美的堆砌，在分子间会有许多间隙 ( 如图 2 ；参 15 ) 。 这些分子间隙通常常由占晶体体积一半以上的溶剂分子所占据，这些溶剂分子的绝大部分在晶体中是无序排列