实验流程Western Blot.doc

浙江省中医院 排版 次 蛋白SDS电泳及Western Blot印迹技术 审阅人： 共 页 概述 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是蛋白质分析过程中最常用的技术，通常在电泳分离时，其迁移率主要取决于蛋白质本身所带的电荷多少、分子量大小和形态。但如在PAGE中加入阴离子去污剂SDS，SDS将蛋白质的二硫键、氢键及疏水键打开，使蛋白质变性， SDS将包裹在变性蛋白表面，使蛋白质成为刚性分子；同时，由于SDS带有大量负电荷，使蛋白质本身带有的电荷可忽略。因此，不同蛋白质分子的迁移率主要决定于蛋白质分子的大小。因此利用SDS可测定蛋白质的分子量。 Western blot是指利用SDS电泳，将各种蛋白质分离开后，通过电泳转移印迹到固相硝酸纤维素膜上，然后利用特异性抗体进行酶联免疫反应（ELISA），它具有特异性高，灵敏度好等优点。固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。 Western Blot所用的酶主要为碱性磷酸酶（AP）和辣根过氧化物酶（HRP）。用AP标记的第二抗体可检测出10-15 pg的抗原；用HRP标记的第二抗体可检测出0.5-1.0 μg的抗原。 主要试剂的配制 1.0 mol/L Tris·HCl（pH 6.8和7.5）： Tris (三羟甲基氨基甲烷，MW 121.14) 30.29 g 蒸馏水 200 ml 溶解后，在通风柜内加入适量浓盐酸（大约用量见下表所示）。然后用1 M HCL调pH至6.8或7.5，最后用蒸馏水定容至250 ml，室温下保存。 所需的pH值 6.8 7.4 7.5 7.6 8.0 8.8 大约需加入HCl量 18 ml 17 ml 16 ml 15 ml 10 ml 7 ml 10％SDS： SDS（十二烷基磺酸钠） 10 g 蒸馏水至 100 ml 50℃水浴下溶解，室温保存。SDS需在通风柜内取样。 10％过硫酸铵（APS）： 过硫酸铵 0.1 g 超纯水 1.0 ml 现配现用，不超过一周。 1.5 mol/L Tris·HCl（pH 8.8）： Tris (MW 121.14) 45.43 g 超纯水 200 ml 溶解后，在通风柜内加入适量浓盐酸，然后用1 M HCL调pH至8.8，超纯水定容至250 ml，室温下保存。 胶的配制（胶浓度为Acr/Bic的浓度g/ml）： 10％分离胶（两块胶15 ml）） 5％浓缩胶（两块胶5 ml） 超纯水 6 ml 3.4 ml 30％Acr/Bic（29：1） 5 ml 0.83 ml 1.5 mol/L Tris·HCl（pH8.8） 3.75 ml － 1 mol/L Tris·HCl（pH6.8） － 0.63 ml 10％SDS 150 μl 50 μl 10%APS（过硫酸胺） 150 μl 50 μl TEMED 7.5 μl 5 μl 加TEMED后，立即混匀即可灌胶。配胶在通风柜内操作。还原型2×SDS上样缓冲液： 0.5 mol/L Tris·HCl（pH 6.8） 5 ml 10%SDS 20 ml 溴酚蓝 甘油 10 ml 双蒸水 10 ml 临用前加入β-巯基乙醇5 ml，混匀后4℃保存。加β-巯基乙醇应在通风柜内操作。 10×电泳缓冲液： Tris