ELISA酶联免疫吸附试验报告.doc

大学实验报告 酶联免疫吸附试验 学院： 专业： 姓名： 学号： 一．实验原理 酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种用酶标记抗原或抗体的方法，此法是将抗原、抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用原理有机地结合起来的技术，可敏感地检测体液中微量的特异性抗原或抗体。基本原理如下：①先使用抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；②使抗原或抗体与某种酶联结成酶标抗原或酶标抗体，这种酶标抗原或酶标抗体即保留了其免疫活性，又保留了酶活性；③试验时，把受检标本（抗体或抗原）和酶标抗原或酶标抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，用洗涤法去除固相载体上的游离物质，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的多少有关。当加入酶反应的底物后，底物被酶催化而产生有色物质。颜色反应深浅与受检抗原或抗体的量成正比。因此，可借助颜色反应的深浅来定性、定量抗体或抗原。本技术的特点是敏感性高，特异性强，操作简易，结果容易观察。 图1 ELISA实验原理示意图 二．实验材料 BSA抗原、兔抗BSA抗体（一抗，分别用PBS稀释成1:2, 1:4, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256七个浓度）、酶标羊抗兔IgG（二抗）、0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在检测仪上，于40nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。滴加太快，很容易出现重复滴加或加在两孔之间的现象1）样品和试剂从冰箱取出后，应在室温下(18～25℃)平衡1h。 在操作过程中，加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。溅出会对邻近孔产生污染。出现气泡则反应液界面有差异时，请勿用带纸屑的吸水材料拍板，以防外源性过氧化物酶类或氧化还原物质与显色液发生反应，影响检测结果的准确性。（腹腔内注射 从耳静脉注射抗原0.1－0.2mL，一周后放ELISA常见方法?（1）间接法?将已知抗原吸附（又称包被）于固相载体，孵育后洗去未吸附的抗原，随后加入含有特异性抗体的被检血清，感作后洗除未起反应的物质，加入酶标记的同种球蛋白（如被检血清是鸡血清，就需用抗鸡球蛋白），作用后再洗涤，加入酶底物。底物被分解后出现颜色反应，用酶标仪测定其吸光值（OD）。?（2）双抗夹心法?用于检测抗原。将特异性免疫球蛋白吸附于固相载体表面，再加入被检抗原溶液，使抗原和抗体在固相表面形成复合物。洗除多余的抗原，再加入酶标记的特异性抗体，感作后冲洗，加入酶底物，颜色变化与待测样品中的抗原量成正比。?（3）竞争法?用酶标记抗原和未标记抗原共同竞争有限量的抗体的原理，测定样品中的抗原。同时应用只加酶标记抗原的系统作为对照。将抗体吸附于固相载体表面，感作后冲洗，加入待检抗原和酶标记抗原。对照只加酶标记抗原。感作后冲洗，加入酶的底物溶液，含酶标抗原的对照应出现颜色反应。而待检系统中，由于样品中未标记抗原的竞争作用，相应抑制了颜色反应。当待检抗原含量高时，其对抗体的竞争能力强，形成的不带酶的抗原-抗体复合物量亦多，带酶复合物的形成量相对减少，产生的有色产物量也少；反之，待检抗原含量低时，不带酶的复合物少，带酶的复合物量相对增多，最后有色产物的量增多。?除上述方法外，近年来还发展了许多改良方法，如阻断ELISA、LISA、抗体捕捉ELISA等，实际检测中可选择应用。?操作步骤ELISA常见方法??? 方法 步骤 间接法（测抗体） 双抗体夹心法 （测抗原） 竞争法（测抗原） 抑制性测定法 1 包被抗原：用包被缓冲液稀释抗原至最适浓度（5～20μg/ml）各0.3ml加于微反应板每个凹孔中,4过夜或37水浴2～3小时,贮存冰箱 包被抗体：用包被缓冲液稀释特异性抗体球蛋白至最适浓度（1～10μg /ml），每凹孔加0.3ml，4过夜，或37水浴3小时，贮存冰箱 包被特异性抗体： ? 同左 包被抗原： ? 同左 2 洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20）洗3次，每次5分钟 同左 同左 同左 3 加被检标本：每凹孔加入用含有0.05%吐温-20的稀释缓冲液稀释的被检血清各0.2ml，37，作用1～2小时 每凹孔加入0.2ml用稀释缓冲液稀释的含抗原的被检标本，37作用1～2小时。 分2组,a组加酶标记抗原和被检抗原混合液0.2ml，另一组只加酶标记抗原液0.2ml，37作用1～2小时。（混合液可作成不同稀释度）。 a组加参考抗体和被检抗原混合液0.2ml，另一组加参考抗体与等量稀释剂0.2ml