二苯乙烯苷对H2O2导致的大鼠海马神经元氧化损伤的保护作用研究.docVIP

精品论文 参考文献 二苯乙烯苷对H2O2导致的大鼠海马神经元氧化损伤的保护作用研究 辽宁省中医院 110032 摘要：目的：探讨二苯乙烯苷（TSG）对H2O2导致大鼠海马神经元氧化损伤的保护作用及机制。方法：将培养9d的大鼠海马神经元随机分为正常组、模型组、给药组（10，50，100 mu;molmiddot;L-1 TSG）。正常组不做任何处理，模型组给予50mu;molmiddot;L-1 H2O2，作用24h；给药组在给予H2O2前24h加入不同浓度的TSG；CCK-8法检测各组海马神经元的存活能力；硫代巴比妥酸检测丙二醛含量；黄嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶活性；RT-PCR法检测各组海马神经元中CREB和BDNF mRNA的表达。结果：给药组大鼠海马神经元的存活能力和SOD活性较模型组显著增强（Plt;0.01）；MDA含量显著降低（Plt;0.01）；CREB和BDNF mRNA的表达明显升高（Plt;0.01）。结论：TSG对H2O2诱导的大鼠海马神经元氧化损伤有明显的神经保护作用，这可能与激活了CREB/BDNF通路有关。 关键词：H2O2；神经元氧化损伤;研究 中图分类号：R285.5 文献标识码：A 1材料与方法 1.1试剂 二苯乙烯苷购自中国药品检验院，溶于聚乙二醇-400（天津科密欧）配成各浓度待用。DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium ,Gibco公司)，胎牛血清( fetal calf serum, FBS, Gibco 公司), 青-链霉素(penicillin-strepotomycin, P/S, Thermo公司)，H2O2（上海桃浦化学试剂公司）；一抗为兔抗NF-M（北京博奥森）；二抗为Cy3 标记驴抗兔 IgG (北京博奥森)，DAPI 染色液（碧云天），Cell Counting Kit CCK-8 试剂盒（Dojindo），丙二醛（MDA）测试盒（南京建成生物工程研究所），超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo），PCR Master Mix Kit（Thermo）。 1.2仪器 倒置荧光生物显微镜 (FM-500，上海普丹)，CO2培养箱 (SCO2W-2，SCO2W-2)， PCR仪 (MG96G，杭州朗基)，凝胶成像系统 (2500R，上海天能)，紫外可见分光光度计 （UV9100，邢台润联），酶标仪（dnm-9602a，邢台润联） 1.3动物 SD雄性大鼠体重（200plusmn;20）g，购自辽宁长生生物技术有限公司，合格证号：SCXK（辽）2010-001，光明：黑暗=1:1，室温（22plusmn;2）℃，相对湿度55%~65%。喂养1周稳定后用于实验。 1.4大鼠海马神经元的分离与培养 取各组大鼠大脑并分离出海马，剪碎并用0.25%胰蛋白酶于37deg;C消化15min，终止消化后经筛网过滤，得到细胞悬液。细胞悬液以5times;109middot;L-1的密度接种于经多聚赖氨酸包被过的24孔板中，加入含有10% FBS和1% P/S的DMEM高糖培养基，置于37deg;C，5% CO2-95% 空气培养箱中培养。3~4d后加入3mu;molmiddot;L-1的阿糖胞苷，1d后更换新的培养基，以后每3d半量换液。培养9d后用兔抗NF-M抗体进行免疫荧光染色，并在倒置荧光显微镜下进行观察 [1]。 1.5造模与分组 将原代培养的神经元随机分为3组：正常组，造模组（培养基中加入50 mu;molmiddot;L-1 H2O2，作用24h），给药组（在加入50 mu;molmiddot;L-1 H2O2前给予10，50，100 mu;molmiddot;L-1 TSG，作用24h）。 1.6 CCK-8检测细胞的活力 将神经元以5times;109middot;L-1的密度接种于经多聚赖氨酸包被过的96孔板中，并以上述分组每组设3个复孔。培养到9d后，每孔加入10 mu;L CCK-8溶液，37℃孵育4h，并在450nm 处检测吸光度。重复3次。 1.7MDA含量和SOD活性的测定 脂质过氧化的降解产物之一的MDA可与硫代巴比妥酸（TBA）缩合，形成红色产物，在532nm处惊醒比色测定来检测MDA相对含量变化；黄嘌呤氧化酶反应体系产生超氧阴离子自由基，并经氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂作用下呈红色，并用分光光度计检测吸光度来计算样品中SOD活性。将海马神经元以5times;109mi