关中奶山羊和贵州黑山羊Pit1基因的PCRRFLP和PCRSSCP分析研究.pdfVIP

No．1 Animal Bulletin 519 (Octobet2006)V01．10 Biotechnology 滑留帅1，蓝贤勇1，陈宏1一，雷初朝1，李俊营1，于姣1，胡沈荣1 (1．西北农林科技大学动物科技学院，陕西省农业分子生物学重点实验室，陕西杨凌，712100；2．徐 州师范大学细胞与分子生物学研究所，江苏徐州，221116) 摘要：奉研究利用PCR—R凡J和PCR、SSCP技术首次对关中奶山羊和贵州黑山羊垂体释放 因子1(Pit-1)基因进行多态性检测和分析。结果表明，限制性内切酶Hinfl在该基因位点上不 存在多态性；而PCR-SSCP结果首次揭示该基因位点存在多态性，其中，关中奶山羊和贵州黑 山羊存在A／B／C三种构型． 关键词：山羊；Pit-1基因；PCR．RFLP；PCR-SSCP 垂体释放因子，在垂体发育和激素表达中起主要作用，在遗传学研究中有重要的意义。其主要功能是调 节细胞的分化、调控动物生长发育。因为该基因主要正向调控促甲状腺激素B亚单位(TSHB)、生长激 素(GH)和催乳素(PRL)基因的表达，对哺乳动物生长发育、新陈代谢起重要的调控作用，能提高生 长速度、降低脂肪沉积等。因此，Pit-1基因可作为产奶性状和产肉性状的重要候选基因之一11月。然而截 至目前，国内外关于山z}kPit-1基因多态性研究尚未见报道。 关中奶山羊是我国培育出来的奶用山羊品种之一，系陕西境内的优良地方品种，以体形较大、乳用 明显、产奶量高、遗传性稳定、适应性强著称，该品种现主要分布于富平、三原和扶风以及千阳等地o； 贵州黑山羊是贵州优良的地方品种，具有产肉性能好、适应性及抗病性强等特点，是贵州主要的山羊品 异，为该候选基因在山羊遗传育种中的应用提供科学资料。 l材料和方法 1．1实验动物，药品及基因组DNA的提取 62份关中奶山羊(Gz)样品分别以随机方式采自陕西省丹凤县种羊场种和关中地区，2l份贵州黑山羊 (GB)肌肉样品来自贵州水城县，样品获得后立即置于冰盒中带回实验室并置于_80℃保存备用。基因 组DNA提取参考Chen[31等方法。 1．2PCR反应 2|o mmol／LdiWrPs2．0 liE，2．5 uL，0．5U，皿TaqDNA聚合酶2．0uL，混合引物(上游引物和下游引物各 PCR反应程序：95C预变性5min， 为5pmol机L)为1．0uL，50ng，lIL模板DNAl．5肛，，加水至25“L min。 然后35个循环(94℃变性30S，54．5℃复性30s，72℃延伸加s)，最后72。C延伸10 1．3PCR-RFLP和PCR-SSCP分析 ·基金项目：西北农林科技大学拔尖人才支持计划基金和西北农林科技大学研究生教育创新基金(05YCH018)资助。 作者简介：滑馏帅(198l一)，在读硕士研究生，研究方向：生物技术与家畜育种。 第十次全国畜禽遗传标记研讨会论文集 PCR-RFLP的酶切反应体系：10x缓冲液R+(含BSA)2皿，Hinfl(1U／uL)8皿，PCR产物8皿” 补水至22 uL’经瞬时离心后置于37℃恒温水浴摇床中消化过夜，消化后PCR产物于4％的琼脂糖电泳、 成像。PCR-SSCP分析：取8uLPCR产物于一灭菌离心管中，加等体积变性上样缓冲液混合；98℃变性 10 mill后，立即冰浴5rain以上，上样于30％聚丙烯酰胺凝胶中电泳；电泳后0．1％硝酸银染色，银染后 扫描仪成像保存；利用Kodak120系统进行带纹分析，确定PCR．SSCP基因型。 1．4数据分析 J 性f检验和基因型与基因频率分布的独立裆分析，均由SPSS(13．o)软件完成。 2结果与分析 2．1 PCR扩增产物及PcR．RFLP分析 451 产物电泳结果见图2。目的基因片段被切为244bp和207 bp片段，均表