早孕家兔卵巢间质细胞体外培养体系的建立研究.pdfVIP

早孕家兔卵巢间质细胞体外培养体系的建立 硕士研究生:利光辉 指导教师:靳亚平副教授 (西北农林科技大学家畜生殖内分泌与胚胎工程农业部重点开放实验室，中国杨凌 712100 摘要 为研究卵巢间质细胞在卵巢生理和病理过程中的作用，本研究以家兔卵巢为试验材 料，采用胶原酶和胰蛋白酶消化，成功地分离了卵巢间质细胞。通过原代培养、传代培 养及鉴定等研究，建立了卵巢间质细胞的体外培养体系，了解了家兔卵巢间质细胞在体 外培养过程中的生长特性。结果表明: 1在用相同酶的条件下，冷消化所得细胞的活力较高，但细胞数量少，消耗时间多; 在应用相同的消化方法，用不同的酶时，0.1%的XI型胶原酶和 0.1%的III型胶原酶均可 获得接种量的原代培养物，但用0.1%的XI型胶原酶消化能较好的分离卵巢间质细胞， 对细胞的损伤小，获得的细胞培养时贴壁率高。接种后24h，细胞大部分贴壁。原代细 胞7-8d可汇合形成单层。用0.1%的III型胶原酶也能得到较多的细胞，但细胞贴壁慢。 2对于成年家兔的卵巢用0.1%的XI型胶原酶消化20min获得的卵巢间质细胞最多。 消化时间可适当延长5-10min，如果消化时间掌握不好，则很难得到足够的接种量细胞。 3以上两种胶原酶与2.5留L胰蛋白酶-0.2创LEDTA相比，结合用注射器吹打更适合 于卵巢间质细胞的消化传代。 4与其它几种常用培养基相比，Hams/F-12/DMEM(1:1)为卵巢间质细胞的最佳培养 基。 5基础培养基中添加血清和胰岛素或ITS培养可明显促进卵巢间质细胞的生长和增 殖。在血清饥饿的条件下，生长成单层的细胞仍能维持活力较长时间，细胞的生长增殖 对血清有依赖性。在不添加胰岛素和ITS时，卵巢间质细胞难以生长成单层。 6从功能活跃时期的卵巢获得的卵巢间质细胞较容易培养成功，而从乏情期卵巢获 取的细胞不容易培养成功。卵巢间质细胞的体外生长受在体时家兔所处的生理时期的影 响。 7建立了卵巢间质细胞的体外培养体系。确定Ig/LXI型胶原酶、热消化20-30min 为最佳消化方法，HamsF-I2/DMEM(1:1)为基础培养基，添加血清、胰岛素或ITS，促 进细胞的分裂增殖。 8选择卵巢间质细胞特异表达产物P450Scc和30-HSD用免疫细胞化学方法成功地鉴 定了此细胞。用DAB呈色，卵巢间质细胞的线粒体染成蓝色，胞质染成红棕色。 关键词:卵巢间质细胞:培养:鉴定:家兔 ESTABLISHTHECULTIVATIONOFOVARIANINTERSTITIALCELL INEARLYPREGNANTRABBITINVITROANDIDENTIFYTHECELL Postgraduate:LiGuanghui Supervisor:AssociateProfessorJinYaping (KeyLaboratoryofAnimalReproductiveEndocrinologyandEmbryoBiotechnologyof AgricultureMinistryofChina,NorthwestSci-TechUniversiytofAgricultureand Forestry,YangLing,Shaanxi712100,China) Abstract:thepurposesofthepaperaretoresearchthefunctionoftheovarianinterstitial cell(OIC)intheovarianphysiologyandpathology.Wesuccessfullyisolateandculturethe OICfromearlypregnantrabbitbyusingdifferentdissociatingsolutions(collagenasesand trypsin-EDTA)andmethods(dissociationat37℃，20-30minandat4℃，4-5h respectly).GrowthcharacterofOICares