引物长度一般在5碱基之间.PPTVIP

引物设计 冷 丽 2011-04-02 引物设计需要考虑的问题 引物长度（primer length） 产物长度（product length） 序列Tm值(melting temperature) ΔG值(internal stability) 引物本身和引物之间二聚体及发夹结构 错误引发位点（false priming site） 引物及产物GC含量（composition） PCR引物设计原则 1. 引物长度一般在15~30碱基之间。 引物长度常用的是18-27 bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。 2. 引物GC含量在40~60%之间，Tm值最好接近72℃ GC含量过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值是寡核苷酸的解链温度，即50%寡核苷酸双链解链的温度。一般有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。 PCR引物设计原则 3. 引物3’端要避开密码子的第3位。 如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 4. 引物3’端不能选择A。 引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。 PCR引物设计原则 5. 碱基要随机分布。 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。 6. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′ 端的互补重叠以防止引物二聚体的形成。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。 PCR引物设计原则 7. 引物5’ 端和中间△G值应该相对较高，而3’端较低。 △G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当选用5′ 端和中间△G值相对较高，而3′ 端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。 8. 引物的5’端可以修饰，而3′端不可修饰。 引物的5′ 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′ 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列。 PCR引物设计原则 9. 扩增产物的单链不能形成二级结构。 某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。 10. 引物应具有特异性。 引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。最好与其它基因不具有互补性。 PCR引物设计常用软件 Primer 5，强大的引物搜索功能，限制性内切酶位点分析。 Oligo 6，引物搜索功能，较强的引物分析评价功能。 Primer 5的使用方法 Primer 5的使用方法 Primer 5的使用方法 Primer 5的使用方法 Primer 5的使用方法 Primer 5的使用方法 Primer 5的使用方法 Oligo 6的使用方法 Oligo 6的使用方法 Oligo 6的使用方法 Oligo 6的使用方法 Oligo 6的使用方法 Real-Time PCR引物设计原则 做Real Time时, 引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求： 1）避免重复碱基，尤其是G 2)Tm=58-60度。3）GC=30-80%. 4）3端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C. 5)PCR扩增产物长度： 引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80～150 bp最为合适（可以延长至300 bp）。6)引物的退火温度要高，一般要在60度以上；要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。而且引物设计时应该考虑到