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流式细胞术检测样品制备方法 FCM 样 品 制 作 步 骤 1.实验标本的处理 2.荧光染料的选择 3.抗体的选择 4.实验对照的设计 5.实验操作过程中的注意事项 6.具体例子 （一）FCM单细胞标本的制备 FCM实验检测对象是单细胞悬液，因此，在组织化学和免疫组织化学实验中需把样品制备成细胞悬液，并要求被检细胞大小为0.2～80pm，每个样品中至少有20000个细胞，细胞浓度为105～107个／ml。制备成的单细胞悬液经荧光或免疫荧光标记即可上机检测。 1）单层培养细胞单细胞悬液的制备 1.弃去培养细胞(对数生长期)中的旧培养液，加入1～2ml 0.25％胰蛋白酶，显微镜下观察，见细胞稍变圆时，停止胰蛋白酶作用。也可直接观察培养瓶，静置消化2～3分钟，待细胞逐渐变白，有脱落趋势时，立即竖立培养瓶，停止胰蛋白酶作用，弃去胰蛋白酶； 2. 加入3～4ml无钙离子和镁离子的PBS液，用吸管反复吹打，使其分散为单个细胞悬液，移入离心管中； 3. 离心，去掉上清液，加入约0.5ml PBS液，用振荡器使细胞分散； 4. 在细胞中迅速加入4℃ 70％冰乙醇固定细胞，保存于4℃冰箱中备用。 2）实体组织单细胞悬液的制备 1. 机械法 1)用剪刀剪碎或者用锋利的解剖刀剁碎组织； 2)将剪碎的组织加入匀浆器中匀浆； 3)用吸管或注射器抽吸细胞悬液，以分散细胞； 4)将细胞悬液在尼龙网或不锈钢网上过滤，滤出的细胞悬液细胞计数后即可使用。 2. 酶处理法? 此法是实体组织分散为单个细胞的主要方法。由于不同酶对细胞内和细胞间不同组分有特异消化作用，所以应根据所用组织类型确定使用酶的种类。此外，乙二胺四乙酸(Ethylene diaminetetra acetic acid， EDTA)能结合组织中的二价钙离子和镁离子，而二价钙离子和镁离子有维持细胞表面完整性和维持细胞间质结构的作用，因此，几种酶和EDTA联合使用有助于充分消化实体组织，提高细胞产出效率。 组织消化的一般过程 1) 将组织剪成l～2mm3左右的小块。 2) 用胰蛋白酶（trypsin）或胶原酶（collagenase）消化组织块，胰蛋白酶适用于消化细胞间质较少的软组织，如胚胎、上皮、肝、肾等组织。胰蛋白酶工作浓度一般为0.1％～0.5％。对于纤维较多的组织或较硬的癌组织常用0.25％胶原酶，胶原酶对组织中胶原蛋白类结构消化作用强，它仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大。胶原酶常用剂量为0.1～0.3ug／m1。用大于组织量30～50倍的胰蛋白酶液或胶原酶液在37℃条件下消化组织，需每隔一定时间摇动一次。消化时间的长短依组织类型而定，一般来说，胰蛋白酶需作用20～60分钟，胶原酶需4～48小时。在消化过程中，如发现组织块已分散而失去块的形状，经摇动即可成为絮状悬液，则可取出少量液体在显微镜下观察，可见分散的单个细胞和少量的细胞团，可认为组织已消化充分。 3) 消化完毕后，将细胞悬液通过100目孔径尼龙网或不锈钢网滤过，以除掉未充分消化的组织。 4) 已过滤的细胞悬液经800～1000rpm低速离心5～10分钟后，弃上清液，加PBS液，轻轻吹打形成细胞悬液，细胞计数后即可使用。 3）石蜡包埋组织的流式细胞样品制备 ? 外科手术获得的新鲜实体组织，往往已进行石蜡包埋处理，如果再制成细胞悬液进行流式细胞分析，需将石蜡包埋组织进行以下步骤的处理： ??? (1)将石蜡包埋的组织块切成30mm厚的切片，尽可能除去切片中石蜡成分； ??? (2)将切片置于离心管中，用二甲苯脱蜡2次，10分钟／次； ??? (3)蒸馏水洗2次后，加入lml l％胃蛋白酶溶液中(pH 1．5)，37℃恒温振荡水浴中消化30分钟；??? ??? (4)离心，所获得的细胞沉淀可进行染色和流式细胞术分析。 4) 周围血、骨髓、淋巴样组织、脑脊液等样品的制备 抗凝剂的选择；常用的是EDTA和肝素 EDTA的优点是防止成熟的髓系细胞贴壁造成细胞的损失，并具有较强的抗血小板集聚能力。 缺点：细胞散射光特征丢失较肝素标本快。 样品的保存； 样品中细胞活性与抗凝剂的选择、运输、保存和温度密切相关。 一般室温保存即可，要求采集后立刻处理染色； 肝素抗凝血、髓在室温保存48-72小时； EDTA抗凝血、髓保存12-24小时， 可固定细胞长期保存。 注意事项 抗凝血不能有凝块以免影响结果。 组织制备单个细胞必须进行机械分离后用蛋白水解酶消化。 采用方法裂解红细胞（用于临床）和细胞密度梯度离心分离法（用于科研）。 外周血单个核细胞分离 分离溶液是分离各类细胞的关键，对分离溶液的基本要求是：①对细胞无毒；②基本等渗；③不同于血浆等分离物质；④有一定的比重。 聚蔗糖-泛影葡胺是一种较理想的细胞分层液，