二代测序助力感染性疾病的精准诊疗-生物谷.PDFVIP

军事医学科学院 二代测序助力感染性 疾病的精准诊疗 童贻刚 军事医学科学院 微生物流行病研究所 tong.yigang@ 军事医学科学院 临床微生物检验存在的问题 • 培养阳性率低（培养条件、抗生素等导 致） • 检测种类有限（累计成本高） • 缺乏病原体型别、致病性、耐药信息 • 无法检出罕见、未知和新发病原体 军事医学科学院 高通量测序筛查病原体的优势 • 不依赖于培养 • 死细菌、使用抗生素亦可检出 • 可同时检出病原体型别、毒力基因、耐药基因 • 准确可靠，碱基序列没有模糊信号，不像ELISA、PCR、杂交芯片等 • 通量极大  20bp序列即具有很高的特异性（特异引物长20bp ），每条大于100bp 的序列reads即可确定一个物种  一次可以测出超过1千万条序列，理论上检测病原体通量可以达到1千 万 • 既可以发现已知病原体、又可以发现完全未知的病原体 军事医学科学院 高通量测序已经成为常规技术 • 测序通量越来越大，Hiseq X 10：18T/run，100人60X， 千美元/人，3.6万细菌100X。 • 测序成本大幅下降，PGM测序仪： 1万元RMB/Run • 测序速度越来越快， PGM测序仪： 24小时/Run • 测序质量越来越高， PGM测序仪：≈ 400bp读长 • 测序自动化程度越来越高，自动建库，自动上机， Miseq：人工操作 5小时 • 高通量测序技术大众化的技术，人人都可以拥有 军事医学科学院 美国FDA出台基于二代测序的微生物鉴定 及耐药与独立分析设备指南（草案） 军事医学科学院 病原体测序筛查影响因素  病毒容易发现  容易与宿主分离  环境中少，易于判别  细菌真菌原虫确认难  浓度低  抗生素  恢复期  局部感染未入血  环境微生物  定植微生物 军事医学科学院 病原体测序的关键问题 • 样品的前处理： – 病原体含量低：核酸含量万分之一到百万分之一 – 核酸种类不同：DNA or RNA，建库问题 – 物种差别：原虫、真菌、细菌、病毒，富集问题 – 核酸提取难题：破壁与核酸提取问题 • 数据处理： – 数据库大小与比对速度（本地/在线，特异性/通用 性） – 假阳性与病原体识别（内源病毒，环境微生物） – 致病性判断（定植/感染，文献参考） • 其他手段作为补充：临床指征、细菌培养、动 物攻毒 军事医学科学院 关键问题之一 样本（血液、组织、唾液、尿液、脑脊液、蜱、蚊） 宿主细胞去除 病原体富集