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蛋白质常规层析技术 纯化组—赵波 2010.3 一、层析概述 二、常用层析技术 三、纯化策略 一、层析概述 层析法也称色谱法(chromatography)是1906年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”。 1.层析的原理 层析技术是一组相关分离方法的总称。 当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，而且随流动相向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配，从而达到将各组份分离的目的。 2.层析的分类 按固定相基质的形式： 柱层析、纸层析和薄层层析 2.层析的分类 根据流动相的形式： 液相层析、气相层析 2.层析的分类 二、常用层析技术 亲和层析 离子交换层析 疏水层析 凝胶过滤层析 亲和层析 原理： 亲和层析是利用生物高分子与配基可逆结合的原理，将配基通过共价键结合于载体上而制得的层析系统。这种可逆结合的作用主要是靠生物高分子对它的配基的空间结构的识别。 常用的生物亲和关系有酶-底物、抗体-抗原、外源凝集素-糖蛋白等。 Affinity.swf 填料选择： 重点：选择合适的配基 应用： 原理： 以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离。 通过静电相互作用而使带正电荷的样品结合到阳离子交换介质上，而带负电荷的介质则可结合到阴离子交换介质上，再采用改变盐浓度或者缓冲液的pH值的方法进行洗脱。 Ion Exchange.swf 影响因素： 缓冲液的盐浓度和pH 值。 在进行pH梯度洗脱时，尽量避免跨越蛋白质的等电点。 洗脱策略： 洗脱模式：流穿模式、结合模式。 洗脱方法：分步洗脱法、梯度洗脱法。 分步洗脱一般应用于在其中某一种盐浓度收集一种目标蛋白质，因此也一般应用于已知样品。 梯度洗脱是按一定的浓度梯度连续改变盐浓度进行洗脱，梯度越平缓，分辨率越高，但同时样品越稀。 去除内毒素和DNA： 核酸带强负电荷，在纯化样品时可以利用阳离子交换介质（如SP SFF）结合目的蛋白而使核酸流穿；或者采用阴离子交换介质（Q SFF），使样品流穿而结合核酸。 内毒素是也带负电荷的复合大分子，能与阴离子交换介质较强结合而在阳离子交换介质上流穿。 填料选择： 重点：在于选择合适的分辨率 原理： 根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种方法。 蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团，称为疏水补丁，疏水补丁可以与疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合。 溶液中高离子强度可以增强蛋白质和多肽等生物大分子与疏水性层析介质之间的疏水作用。 Hydrophobic Interaction.swf 影响因素： 盐类，盐可增加水相的极性，提高界面的表面张力，同时可使蛋白质暴露出临近界面的非极性基团，容易形成疏水作用。所以盐浓度越高，促疏水作用越强。 有机溶剂，同盐作用相反，减少疏水作用。 表面活性剂也能减少疏水作用。 不同盐增强疏水配基和蛋白质之间的相互作用 洗脱策略： 在吸附时应适当增强盐浓度以增强蛋白质与层析剂之间的疏水作用力，洗脱可采用低浓度的盐溶液洗脱。 对于结合较强的蛋白质可以在洗脱剂中添加一些温和的有机溶剂如多元醇或表面活性剂来洗脱。 去除内毒素和DNA： 核酸在高盐条件下会和蛋白解离,利用疏水层析介质结合目标蛋白,去除核酸。 热原含脂肪A、糖类和蛋白，其脂肪A部份有很强的疏水性，但在高盐下会凝集，无法上疏水层析。因此可利用疏水层析结合目标蛋白而去除热原。 填料选择： 重点：选择填料的疏水性强弱 配基的类型： 原理： 凝胶过滤层析是根据被分离物分子大小和形状的差异进行分离。 填料含有许多不同大小的孔，体积大的分子不