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北大基础医学生物化学课件 重组DNA技术.ppt 54页

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北大基础医学生物化学课件 重组DNA技术
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基因工程的基本步骤 1、分 2、切 3、接 5、筛 4、转 6、表达 基因工程的基本步骤 基因工程的基本步骤 基因工程的基本步骤 一、化学合成法 目的基因的获得 对已知基因的核苷酸序列,或蛋白质的氨基酸序列,推导出该多肽编码的核苷酸序列,用DNA合成仪经化学方法合成此基因。 【举例】胰岛素原、心钠素等 二、基因组DNA文库(鸟枪无性繁殖法) 目的基因的获得 OH 3? OH 3? OH 3? Oligo dT primer Double-strand cDNA OH 3? TTTnT 5? TTTnT 5? 3? OH AAAnA 5? Poly A tail mRNA Reverse transcriptase dNTPs TTTnT 5? AAAnA 5? OH 3? cDNA Alkali digestion of mRNA template cDNA DNA polymerase I dNTPs AAAnA TTTnT 5? OH 3? AAAnA TTTnT 5? 5? 3? S1 nuclease Single-stranded hairpin susceptible to S1 nuclease mRNA 三、cDNA文库的建立 目的基因的获得 四、DNA聚合酶链反应(PCR) 重组体构建 一、粘性末端连接 1、同一限制酶切割位点连接,碱基配对结合成重组分子。 2、不同限制酶切割位点连接,因有相同末端,经配伍后连接 DNA片段A DNA片段B 5′···G G A T C C···3′ 5′···A G A T C T···3′ 3′···C C T A G G···5′ 3′···T C T A G A···5′ 不同的限制性内切酶水解 混合后经DNA连接酶连接 BamHI BglII ···G G A T C T··· ···C C T A G A··· ···G G A T C T··· ···C C T A G A··· 粘端 重组体构建 配伍末端连接 Complementary homopolymeric tails are added to the ends of the two fragments to be joined. 重组体构建 The optimal substrate for terminal transferase is the 3' OH at the end of a single strand of DNA at least three nucleotides long. 粘端的生成 二、平端连接 平端在T4连接酶作用下可以连接。 三、同聚物加尾连接 利用同聚物序列,如聚A与聚T之间经退火作用完成连接,需末端转移酶。 四、人工接头连接 用人工和成某酶切割序列的接头,与DNA平端相连后形成粘性末端再连接。 重组体构建 重组体构建 刘新文,重组DNA技术 重组DNA技术 刘新文 北京大学医学部生物化学与分子生物学系 第一节 概述 DNA克隆(DNA cloning):应用酶学的方法,在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子—复制子,继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞,再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子的过程。DNA克隆又称基因克隆(gene cloning)。 基因工程(genetic engineering):实现基因克隆所采用的方法及相关的工作。又称重组DNA技术(recombinant DNA technology) 一、克隆体系:目的基因、载体DNA、工具酶、宿主细胞等 1、目的基因(target gene):cDNA或基因组DNA 2、载体(vector):质粒、噬菌体、柯斯质粒载体、病毒和人工染色体等 cDNA (complementary DNA):指体外经反转录合成的,与RNA (常指mRNA)互补的单链DNA,单链cDNA进而合成双链cDNA。 基因组DNA(genomic DNA):代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列,称为基因组DNA。 质粒(plasmid):存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子,在细胞中可以独立进行复制并在细胞分裂时恒定地传给子代细胞。 3.1 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease): 存在于细菌体内,能够识别和切割双链

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