细胞ATPADPAMP含量高效液相色谱法（HPLC）定量检测.docVIP

细胞ATP/ADP/AMP含量高效液相色谱法（HPLC）定量检测试剂盒 产品说明书（中文版） 主要用途 是一种旨在通过在高效液相色谱仪和紫外光下（2nm波长）检测分析，分离出以定量测定样品中的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种动物人体样品的检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。 技术背景 嘌呤核苷酸（adenine nucleotides），简称腺苷，包括单磷酸腺苷、二磷酸腺苷和三磷酸腺苷，是一种单体单位，为核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸（DNA）的组成成分，并提供化学能量，在能量代谢通路中维护诸如肌肉、胞膜等组织细胞结构的生化和生理功能，调节细胞糖酵解、三羧酸循环、电子传递系统、氧化磷酸化活动。腺嘌呤核苷酸在细胞中浓度低，且不稳定，通常通过其类型不同、浓度差异、分布状况，来评价细胞的代谢情况和能量状态。单磷酸腺苷（Adenosine monophosphate；AMP），又称为5-腺嘌呤核苷酸或腺苷酸（5-adenylic acid），是一种在（脱氧）核糖核酸中发现的核苷酸。它是一种磷酸及核苷腺苷的酯，并由磷酸基团、戊糖核酸糖及碱基腺嘌呤所组成。分子式为C10H14N5O7P，分子量347。AMP可以通过腺苷酸激酶（adenylate kinase）催化2分子ADP生成，或通过ATP以及ADP水解产生。AMP常以腺苷-3,5-环化一磷酸（cAMP）形式存在于细胞中。AMP与ATP之比反映细胞ATP生成状况以及脂肪酸氧化程度。二磷酸腺苷（adenosine diphosphate；ADP），参与ADP-ATP循环，提供热能转换和动态平衡，尤其在线粒体需氧呼吸、光合成等实现。三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate；ATP）存在于所有代谢活跃的细胞内，是细胞活力的标志。一旦细胞凋亡或坏死，ATP浓度急遽下降。通过高氯酸酸性处理，排除蛋白质干扰，碱性中和后，在高效液相色谱仪和紫外光度仪下（254nm波长）检测分析，分离出ATP、ADP、AMP波峰，以定量其含量。 存 标准液（Reagent ）在-20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；具有腐蚀性，注意操作安全；有效保证6月 HANK平衡盐缓冲溶液（GMS12028）或PBS缓冲溶液（GMS12033）：用于清理细胞 胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于细胞脱离 完全细胞培养液（GMS12052）：用于细胞处理所需的培养基 15毫升锥形离心管：用于50毫升锥形离心管：用于1.5毫升离心管：用于4℃（微型）台式离心机：用于DOUNCE匀浆器：用于裂解细胞HPLC）：用于定量测定 实验步骤 样品准备准备瓶75cm2细胞培养瓶的细胞（X 107），直至细胞生长铺满整个培养表面 加入10毫升用户自备的HANK平衡盐缓冲溶液或PBS缓冲溶液到每个细胞培养瓶，覆盖培养瓶表面，然后抽去 加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个细胞生长表面 置入37℃培养箱3分种 轻轻手击震动培养瓶，使细胞脱落， 分别加入10毫升用户自备的完全细胞培养液 移入一个50毫升锥形离心管 放进台式离心机离心10分钟，速度为200g 小心抽去上清液 加入毫升预冷的 清理液（Reagent A），混匀细胞 放进台式离心机离心10分钟，速度为300g 小心抽去上清液 加入升预冷的 裂解液 涡旋震荡5秒，充分混匀细胞颗粒群 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器 在冰槽里用匀浆棒匀化细胞（约40下） 将所有细胞匀浆物移入15毫升锥形离心管 放进4℃超速离心机离心10分钟，速度为10000g 小心上清液加入升预冷的液（Reagent ）涡旋震荡 放进4℃离心机再次离心分钟，速度为000g 小心上清液 加入液（Reagent ），充分混匀即刻移入1.5毫升离心管放进－70℃冰箱里Waters仪器或 Agilent仪器 固定相 ODS 流动相 流相液A（Reagent E）和 流相液B（Reagent F） 参见运行程序 流速 1.3毫升/分钟 注射容量 50微升 10微升至100微升 检测 紫外 波长 254nm 柱温 25℃ 出峰时间（retention） 5.6分钟（ATP）；6.5分钟（ADP）；10分钟(AMP)准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管 分别加入100微升液（Reagent ）到至5号管 移取0微升 标准液（Reagent ）到1号管，混匀 小心移取100微升1号管稀释的 标准液（Reagent ）到2号管，混匀 小心移取100微升2号管稀释的 标准液（Reagent ）到3号管，混匀 小心移取100微升3号管稀释的 标准液（Reagent ）到4号管，混匀 将1至5号管放