第六章 ,电泳技术与仪器.pptVIP

五、免疫固定电泳 正常血清标本 Ig G l单克隆免疫球蛋白(近负极端) 六、同工酶电泳 乳酸脱氢酶同工酶(Lactate dehydrogenase, LDH) 肌酸激酶同工酶(Creatine kinase, CK) 碱性磷酸酶同工酶(Alkaline phosphatase, ALP) 天冬氨酸氨基转移酶(Aspartate transaminase, AST) γ - 谷氨酰转移酶(γ- glutamyltransferase, GGT) ? - 淀粉酶同工酶(? -Amylase, AMY) 乳酸脱氢酶同工酶(LDH) 每种LD同功酶都是由4个亚单位(肽链)组成的四聚物 这些亚单位中, 有两类分别专属M(肌肉)和H(心脏)。 H4 = LD1 H3M = LD2 H2M2 = LD3 HM3 = LD4 M4 = LD5 六、同工酶电泳 检测方法--琼脂糖电泳法 原理:以琼脂糖胶作为介质,LDH可分离出五种同工酶区带,根据其电泳迁移率的快慢, 将迁移最快的命名为 LDH1, 依次为 LDH2, LDH3, LDH4和LDH5,最后显色,扫描确定其百分率。 参考值 LDH1 28.4 ± 5.3% LDH2 41.0 ± 5.0% LDH3 19.0 ± 4.0% LDH4 6.6 ± 3.5% LDH5 4.6 ± 3.0% 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 六、同工酶电泳 七、脑脊液蛋白电泳 琼脂糖凝胶电泳和免疫固定原理相结合 利用高分辨技术在琼脂糖凝胶上对脑脊液蛋白进行电泳分离(血清中的免疫球蛋白的浓度应该被稀释到和脑脊液中Ig一样的浓度：5 至 10 mg/L)。 利用与标有过氧化氢酶的特异的抗血清(G, A, M, k, l)之间的免疫反应，免疫球蛋白将会被固定。 过氧化氢酶被激活从而进行显色 : 这种显色反应非常灵敏 (最低可以检测到125-250 μg/L的微量蛋白)。 1 : 脊髓炎 (0.91) 2 : 多发性硬化症 (2.69) 3 : 由癌症引发的脑炎 (0.70) 4 : 多发性硬化症 (0.63) 5 : 多发性硬化症 (3.60) 6 : 多发性硬化症 (0.74) 七、脑脊液蛋白电泳 八、脂蛋白电泳 CAPILLARYS 2 全自动高效液相色谱毛细管电泳仪 Thank you ! 血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C 三、等电聚焦电泳—电荷效应 1．等电聚焦电泳过程 一种利用有pH值梯度的介质，分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。 在一个稳定连续的线性pH梯度的溶液（两性载体电解质）中进行分离，每一种被 分离的两性物质都移向与它的等 电点相一致的pH位置，在那里不 再移动（称为聚焦）。 净电荷与PH的关系曲线 等电聚焦电泳的特点 ①使用两性载体电解质，在电极之间形成稳定、连续、线性的pH梯度；②由于“聚焦效应”，即使很小的样品也能获得清晰、鲜明的区带界面；③电泳速度快;④分辨率高;⑤加入样品的位置可任意选择；⑥可用于测定蛋白质类物质的等电点;⑦适用于中、大分子量（如蛋白质、肽类、同工酶等）生物组分的分离分析。 四、双向凝胶电泳（二维电泳） 第一向采用等电聚焦 根据复杂的蛋白质成分中 各个蛋白质的PI的不同，将蛋白质进行分离。 第二向采用了十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶 电泳 （SDS）就是按蛋 白质分子量的大小使其在垂直 方向进行分离。其结果不再是 条带状，而是呈现为斑点状。 双向凝胶电泳仪 胶性 PH9 中电 加解 入质 了溶 双液 PH3 加上电场后建立稳定PH梯度 蛋白质溶液加入，建立电场 染色后，蛋白质因PI值不同，沿PH梯度分离开 第一向 等电聚焦 PI逐渐降低 等电聚焦胶放在SDS－聚丙烯酰胺凝胶上 第二向 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 分子量逐渐降低 PI 逐渐降低 双向凝胶电泳示意图 第二节 常用电泳方法 毛细管电泳（capillary electrophoresis, CE) 以内径20～200nm的柔性毛细管柱作为分离通道、以高压直流电场作为驱动力，对各种小分子、大分子或细胞等进行高效分离、检测或微量制备等有关技术的总称。 （一）基本原理 电渗流（ electro-osmotic flow, EOF）； EOF是推动流动相的驱动力，对物质的分离起着重要作用 四、毛细管电泳 四、毛细管电泳 （二）优点 热效应低 高灵敏度、高分辨率 所需样品少、检测速度快 自动化程度高、操作简便、成本