核酸实验室污染监测及处理方法.docVIP

精品论文 参考文献 核酸实验室污染监测及处理方法 钟旭琴 戴维 　　(云南省昭通市中心血站 657000) 　　【摘要】 PCR技术是一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术，该技术通过重复高温变性、低温退火、中温延伸等简单的3个温度循环,能将靶DNA扩增数百万倍，获得极高的检测敏感性。但是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的结果。 　　【关键词】 PCR；污染；扩增；气溶胶 　　【中图分类号】R134 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）21-0343-01 　　1.我站PCR实验室基本情况 　　1.1实验室情况 　　1.1.1实验室区域划分 　　将实验室区域划分为三区 ，一区试剂准备间（含缓冲区）、二区样本处理核酸提取间（含缓冲区）、三区扩增分析间（含缓冲区）。样本处理间、扩增分析间为污染区，缓冲区为半污染区，试剂准备间、过道为清洁区。核酸检测报告在检验科局域网电脑上统一以处理； 　　1.1.2按相关要求在实验室内设置应急安全出口； 　　1.1.3半污染区（缓冲区）：其内放置防护服、防护眼镜、一次性鞋套、一次性防护帽、口罩、无粉乳胶手套等个人防护用品，以供实验人员使用； 　　1.1.4试剂准备间气压设置为正常气压、样本处理间气压设置为-5至-10Pa、扩增分析间气压设置为-15至-20Pa。 　　阳性质控品存放于二区冰箱，其他试剂存放于一区冰箱。 　　1.2使用试剂是由江苏华益美生物科技有限公司提供的第五代血液核酸筛查试剂，采用8人份汇集联合检测乙型肝炎病毒(HBV-DNA)、丙型肝炎病毒（HCV-RNA）、艾滋病毒（HIV-RNA）。使用Ausbio的STAR加样仪进行加样汇集提取、赛默飞世尔科技旗下Applied Biosystems ABI7500扩增仪进行DNA扩增。 　　1.3操作人员均是经过卫生部临检中心培训并通过考试取得核酸检测合格证的检验师。 　　2.实验室污染监测及处理方法 　　2.1实验目的 　　PCR具有高灵敏度，但易污染一直是困扰各实验室的大问题，极微量的污染就可能造成假阳性反应，破坏实验结果。 如果形成气溶胶污染而扩散,则可引起整个PCR实验室的污染，处理起来非常麻烦，严重的甚至要关闭PCR实验室。 　　有效监测核酸实验室是否存在污染,以便及时采取措施消除污染源。 　　2.2试验方法 　　2.2.1验证实验室空气中是否有提取片段气溶胶的污染； 　　2.2.2验证实验室是否存在病毒颗粒； 　　2.2.3验证STAR加样通道是否存在污染。 　　2.3试验材料 　　试验用的蒸馏水、离心管、star加样尖、移液器加样尖、八连管、核酸试剂、封板膜、深孔板、汇集管、废液管等材料均为新取或新开封确保无污染。 　　2.4实验过程 　　2.4.1对实验室空气中是否有提取片段污染进行监测。①在STAR上取点（加样尖、样本载架放置处、丢废弃加样尖处），②在实验台面取点，③在生物安全柜取点，④在离心机上取点，⑤在冰箱处取点；另在过道高压灭菌锅处。均用1.5ML离心管装蒸馏水1ML静置于以上位置1小时，共取8个样，不加内标，不做阴阳对照，在生物安全柜内每管手工加样至八联管（每孔加 40ul蒸馏水、20ul扩增确认反应液）后进行扩增。如果扩增结果有阳性，说明实验室中存在提取后的气溶胶，如果扩增结果全阴性，再进行第二步验证实验。 　　2.4.2对实验室是否存在阳性病毒颗粒进行验证。取8支汇集管，每管1.2ml蒸馏水，在实验室中静置半小时，用正常实验过程对蒸馏水进行DNA提取，提取结束后用ABI7500进行扩增，如果扩增结果是阳性，说明实验室中存在游离的病毒颗粒，或者机器的通道出现污染。 　　2.4.3对STAR通道是否污染进行验证，取8支汇集管，分别往汇集管中加入1.2ml的蒸馏水，按照拆分的程序进行实验，实验过程中STAR用到的枪尖都不带滤芯，对提取结束的扩增液进行扩增，如果扩增结果是阳性，说明机器通道出现污染的可能性大。 　　2.5污染处理 　　准备（1：50）、（1：10）84消毒液，75%无水酒精。 　　2.5.1把STAR上的所有载架都拿出来，用1：50的84消毒液进行擦拭，待作用五分钟后用清水冲洗。 　　2.5.2 SATR内部用喷壶喷洒75%无水酒精，底部金属部分可用1：50的84消毒液进行擦拭，待酒精完全沉降后，用清水擦拭。 　　2.5.3实验室内工作台用1：10的84消毒液进行擦拭，实验室内部用喷壶喷洒1：50的84消毒液，等待空气中的84消毒液沉降后，用1：50的84消毒液拖地，建议当天不用清水擦拭或拖地，待第二天早上来再用清水擦拭拖地。 　　2.5.4实验室用的