四株番鸭源H5N1亚型禽流感分离株HA基因的克隆与序列分析研究.pdf

——一一一 垒堕茎生垡銎塑堕塑![壅堑些墨坚塑 四株番鸭源H5N1亚型禽流感分离株HA基因的克隆与序列分析 李芙蓉。12，王永坤1，朱国强’ (1扬州大学兽医学院，江苏扬州，225009；2江苏畜牧兽医职业技术学院，江苏泰州，225300) 摘要：禽流感病毒HA基因较易发生变异，该基因编码病毒表面结构蛋白}IA。HA是病毒的主要保护性抗原， 在病毒入侵细胞的过程中，对病毒的组织嗜性和致病力起着决定性作用。本研究以四株脑坏死病变型H5N1 亚型番鸭分离株为材料，进行了HA基因的克隆测序和序列的分析，进而通过与国内外参考毒株序列同源 性的比较及其基因进化树的构建，以探求毒株致病力差异的分子基础。实验结果表明，病毒HA以点突变 为主，出现酶裂解位点的变化和潜在糖基化位点的增减，但总体未产生大的变异；与国内外毒株同源性较 高，但与陆禽毒株有一定差异。其中，LH株与其他三株相比，变异较大，与今年禽流感流行中的一泰国人 源分离株亲源关系较近。 关键词：禽流感病毒HA基因克隆同源性番鸭 一、 料与方法 1、 材料 1．1种毒 四毒株为2002年底从浙江和福建死亡番鸭分离到的脑坏死病变型毒株，由本实验室保存，经国家流感中 心标准HA、NA单因子血清鉴定为H5NI亚型禽流感病毒。 1．2菌种及主要生化试剂 I酶、Marker^DNA／EcoRI+Hindm购自大连宝生物公司。 自华美生物工程公司，EcoR52 1．3试剂盒 RT—PCR Vector TotalRNAIsolation Kit和pGEM—T RNAgent System、Access GelExtraction 公司，QIAquick Kit购自QIAGEN公司。 1．4缓冲溶液 1．4．1 50 ml冰乙酸，lOOmlO．5M XTAE：2429TriS，57．1 EDTA(pH8．0) x。 加ddmO至1L，使用液为1 1．4．2碱裂解法提取质粒用溶液 SolutionII：0．2MNaOH，1％(w／v)SDS，现配现用。 SolutionIII：3M NaAc，用冰乙酸调pH至4．8。 2、 方法 2．1病毒的增殖与提纯 258 垒堕茎燮笪茎塑堕笙堡垒堑些墨兰塑 一一一一． 链霉索(2000 存备用。 2．2病毒RNA的提取 TotalRNAIsolation 参照RNAgent System的说明进行。 2．3 HA基因的扩增 2．3．1引物的设计与合成 参照国内外已发表的HA基因全序列，由大连宝生物公司合成以下引物： Pl(上游引物)：5’AAAATGGAGAGAATAGTGCTT3’ P2(下游引物)：5’cTAc^ATCTG从cTc从T从AT3’ z．3．2HA基因的RT～PCR扩增 RT-PCR 参照Access Kit的说明进行。 ReactionBuffer 反应体系为：Nueluse—Free-Water 13Itl；AMv／Tfl lOp．1：dNTPMix1pl：P15pl： P2 DNA MgS04 Transcriptase Polymerasetemplate 5“l；25llIM 41xl；A州Reverse l“l；Tfl I斗I：RNA lOul：Total 50pl。 个循环