小鼠胚胎干细胞和胚胎生殖细胞的分离培养研究.pdf

摘 要 小鼠胚胎干细胞和胚胎生殖细胞分离培养 硕士生:金立方 导师:王新庄 研究员 摘 要 为提高昆明白小鼠ES细胞建系效率，实验体外培养了小鼠ES/EG细胞，对影响小鼠 ES/EG细胞分离与克隆的某些因素进行了探讨。以昆明白小鼠胎儿成纤维细胞为饲养层， 低糖DMEM添加巧01oFBS-F2.2g/L或3.7g/LNaHCO,十0.1mM2-琉基乙醇+2nM谷氨酞胺+ 工OOOIC/mLhLIF+1OOIG/mL卡那霉素为培养液，分离培养 3-3.5日龄小鼠胚胎及 8.5dpc-12.5dpc生殖峭PGCS细胞，并对ES/EG集落进行了鉴定、传代和克隆。主要实 验结果如下: 从712枚昆明白小鼠早期胚胎中成功分离出302个原代ES细胞集落，最高传至9 代:从 184个胎儿生殖靖PGC细胞中分离出476个原代EG细胞集落，最高传至8 子to 2.在添加浓度为 2.2g/1.Va]IGO:，的干细胞培养液中胚胎贴壁率、工CM克隆形成率、ES 克隆形成率分别为75Y6,68%和61%;而在添加浓度为3.7g/LNaHCO的干细胞培 养液中胚胎贴壁率、工CM克隆形成率、ES细胞集落形成率分别27%,24%和8%， 两者差异极显著。 3.3日龄桑堪胚和 3.5日龄囊胚贴壁率、ICM克隆形成率和 ES克隆形成率分别为 (30%,30%,18%)和 (75%,68%,61%)，两者差异极显著。 4.自然发情交配获取的囊胚的用:胎贴壁率、1CY1克隆形成率和ES克隆形成率 (为90 %，85%和83%)均显著高于超数排卵交配获取的囊胚 (为75%,68%和61%)0 5.添加外源LIF可显著提高ICM克隆形成率和ES/EG集落形成率，但对胚胎贴壁并无 作用:添加浓度范围在250-1000丁U/ml时，LIF作用效果不呈量效关系。 6采用 “多次消化法”平均每个生殖晴可得 1.89个P。代EG细胞集落，而采用 “一 次消化法”平均每个生殖靖仅获0.68P。代EG细胞集落，两者差异极显著。 7.采用方法I丁丁(用0.1%胰蛋白酶-0.01%ED丁A消化含饲养层的干细胞集落2min- 3min后，轻敲培养皿底部使ES/EG集落脱壁，培养液中和后将脱壁的ES/EG集落 机械吹散成小细胞团块再转移培养)可获得较高ES/EG克隆率和传代数，且方法简 单、易行。 关键词:小鼠;胚胎干细胞;胚胎生殖细胞;分离;鉴定 小鼠胚胎干细胞和胚胎生殖细胞分离培养 Isolationandcultureofmouseembryonicstemcellsandembryonic germcells Postgraduate:JinLifang Tutor:Prof.WangXinzhuang (CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestSci-TechUniversityofAgricultureand Forestry,Yangling,Shaanxi,ER.China,712100) ABSTRACT ThemajorobjectofthispaperistoincreasetheefficiencyofestablishmentKunMing alboninestrainmouseES/EGcelllines.Somefactorsinfluencingtheefficiencyofthe isolationandcultureofmouseES/EGcellshavebeendiscussed.Usingtheprimarymurine embryofibroblastasfe