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家蝇蛆抗菌肽的分离纯化和性质研讨.pdf 143页

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华中科技大学 博士学位论文 家蝇蛆抗菌肽的分离纯化和性质研究 姓名:陆婕 申请学位级别:博士 专业:生物化学与分子生物学 指导教师:陈正望 20051104 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 * 摘 要 家蝇 (Musca domestica) 属昆虫纲,双翅目,环裂亚目、蝇科,是我国大部分地 区最常见、数量最多的一种蝇类。家蝇中存在大量抗菌活性物质,对抗菌药物的开发 具有重要的意义。但家蝇中抗菌肽的种类较多,成分复杂,很难分离纯化出一个单一 抗菌肽,目前国内外对其研究较少。本研究从家蝇干蝇蛆中分离纯化出了一个新抗菌 肽Muscatoxin并测得其氨基酸序列,也深入开展了生理功能的研究。完成的工作主要 包括以下几个方面: 1、利用短时沸水处理、稀醋酸低温浸提、海藻酸吸附、稀盐酸低温洗脱、盐析、 凝胶过滤、CMC23 弱阳离子交换柱层析、反相高效液相色谱层析等方法,从家蝇蛆 中分离纯化出一组蝇蛆抗菌肽,具有抗菌谱广,最低杀菌浓度低,耐热、耐冻融能力 极强等特点。其杀菌活性高低依次为:枯草杆菌>苏云金芽胞杆菌>金黄色葡萄球菌> 铜绿假单孢菌>大肠杆菌,最低杀菌浓度依次为:0.039、0.078、1.25、5.0、20.0 μg/μl 。 + - 蝇蛆抗菌肽不是凝集素类物质,对 G 菌的杀灭作用比对 G 菌强,对抗菌药物的开发 有重要意义。此外,蝇蛆抗菌肽中存在的大量弱酸性蛋白也有杀菌活性。 2 、结合反相高效液相色谱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳和电洗脱回收等方法,首 次在蛋白质水平上,从蝇蛆抗菌肽中分离纯化出一个高纯度的新抗菌肽 Muscatoxin , 分子量 7095 D,等电点 8.88,肽质量指纹谱(PMF)分析表明其为一新肽,Edman 降 解测得其 N 端 40 个氨基酸序列为 SQLGDLGSGA GKGGGGGGSI REAGGAFGKL EAAREEEYFY ,N 端有六联体的 Gly、二联体的 Gly 和三联体的 Glu 结构域,可归类 于富含 Gly 的抗菌肽。Muscatoxin 可能存在蛋白质翻译后修饰。 3、经 GeneBank 数据库查询,Muscatoxin 是一个未曾报道过的新肽,其基因在 原核生物和真核生物中都有。此序列与基因库中由果蝇 Drosophila melanogaster 的 NM_166597 和 AY071315 基因推导拟蛋白的 24~63aa 同源性达 97.5%,序列高度一 致,仅第三位 Val 变成了 Leu(这两种氨基酸的疏水性质很相似) ;果蝇中该拟蛋白的序 * 本研究课题得到国家自然科学基金(30370647 ), 国家 863 计划(2002AA214061 )资助 I 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 列是从基因序列推导而来的,我们首次从蛋白质水平上分离纯化出了该多肽。 + 4 、采用扫描电镜技术,发现蝇蛆抗菌肽 Muscatoxin 能破坏 G 菌(枯草杆菌、苏 云金芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌)和 G-菌(铜绿假单孢菌、大肠杆菌) 的细胞膜,使其 形成穿孔,原生质泄漏而死亡; 5、蝇蛆抗菌肽 Muscatoxin 能杀灭单核白血病癌细胞(THP-1 )。经 Muscatoxin (2mg/ml )处理后,白血病癌细胞的贴壁性很快被破坏,大量细胞悬浮并死亡。扫描 电镜观察发现,悬浮细胞的细胞间质明显减少,细胞形态发生变化,细胞膜出现大量 穿孔、原生质泄漏,细胞破裂死亡。Mu

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