小发夹RNA体外抑制HBV表面抗原的表达研究.pdfVIP

小发夹RNA体外抑制HBV表面抗原的表达 羊正纲，陈智．倪勤．徐宁．邵俊斌．姚航平 浙江大学医学院附属第一医院传染病研究所，浙江省杭州市，中国 摘要 目的：利用载体系统表达小发夹R_NA(Sillal]hairpin interference，RNAi)为抗病毒研究提供一种新的方法。 方法：构建含乙肝表面抗原和绿荧光蛋白(I-IBs．GFP)融合基因的载体和表达小发夹RNA (shRNA)的载体，共转染到HepG2细胞中，流式细胞仪检测融合基因的绿荧光表达情况， 同时用荧光定量RT-PCR检测其RNA水平的改变；选择有效的shRNA表达载体，转染 HepG2．2．15细胞系，放射免疫法检测上清中HBsAg和HbeAg的分泌情况。 结果：流式细胞仪检测发现针对HBsAg的shRNA抑制绿荧光蛋白的表达，抑制率较空载体 对照组下降56％，荧光定量RT-PCR检测结果显示，其mRNA水平降低明显，抑制率较空 and 64％。 载体下降90％。转染HepG2．2．15细胞系后．I-IBsAgHBeAg分别下降了43％and 结论：小发夹RNA可以有效抑制HBVS基因的表达，同时建立一种可行的筛选RNAi作用 靶位的方法。 介绍 慢性乙型肝炎是我国的高发疾病之一，是导致肝纤维化和肝癌的主要原因。目前治疗慢 性乙型肝炎的药物主要是以a干扰素为主的免疫调节剂和以拉米呋啶、阿的福韦为主的抗病 毒药物，但是临床治疗效果不甚满意，其中最主要原因是HBV在细胞内持续地复制。 RNA干扰是近年来生命科学的一个重大发现，其原理是同源双链RNA导入宿主细胞． 通过对目标基因mRNA的特异性切割或降解作用，导致目标基因的不表达或减效表达…， 该现象在各种生物中广泛存在。但是在哺乳动物细胞中，只有21—23核苷酸长度的双链干扰 RNA(smallRNA，s嘏NA)可以引起同源基因的表达沉默拉刁J，长双链的RNA只能 interfering 引起干扰素样的非特异性的蛋白抑制。RNA干扰具有高效，特异，快速等优点，很快被应 用于抗病毒、生物体基因的表达，调控和功能分析．但是由于化学合成的siRNA价格昂贵 且容易降解，因此有学者利用载体表达小发夹RNA(smallRNA，shRNA)取代 hairpin siRNA，在体外和体内实验中均取得了显著的抑制效果o8-121。 计了二个靶位，并构建了相应的shRNA表达载体，与HBS基因载体共转染到HepG2细胞 后，发现载体表达的shRNA在蛋白和RNA水平均显著抑制了HBS基因的表达，并在乙型 肝炎病毒复制的细胞模型HepG2．2．15细胞系中得到证实。 基金项目：国家自然科学基金资助项目和浙江省科技厅重大项目资助 1 1．8706873l 电话：+8锄57 传真：+86．057 材料和方法 材料 试剂 DNA聚合酶购自大连宝生物 限制性内切酶和TaqDNA聚合酶购自Promega公司；Pgobest 公司，纯化试剂盒购自Qiagene公司；T4连接酶，Tdzol和Lipofectamin2000为Invitrogene 公司产品；逆转录酶fM-MLV)和T4多核苷酸激酶购自MBIFermentas公司；胎牛血清购 自杭州四季青生物工程有限公司；所有PCR引物由上海博亚生物技术有限公司合成；SYBR Gold染料由Molecular Probe公司提供。HBsAg和HbeAg固相放射免疫试剂盒购自山东三 维诊断技术有限公司。 质粒，细菌，细胞系 of (EngelkeLab，DepartmentBiological 公司；大肠杆菌DI-15 a及HepG2，HepG2．2．15细胞系均为本所保存。 方法 HBs．GFP融合载体的构建 oC cc30 cc30