免疫沉淀类试验.ppt

方法评价： 优点： ① 灵敏度比单扩法高5—10倍； ② CV小于10％； ③ 操作简便快速，1h可报告结果； ④ 结果准确，且能用全自动化或半全自动化仪器进行分析，尤其随着胶乳粒子增强浊度测定法的出现，使敏感度提高，其应用更加广泛。 缺点： 抗体用量较大； 检测需抗原抗体反应达到平衡，耗时较长； 不宜用于药物等半抗原的测定； 灵敏度较散射比浊法低。 散射免疫比浊法 原理： 散射光系指一定波长的光沿水平轴照射，碰到小颗粒的免疫复合物，光线被折射，发生偏转，这种偏转的角度可因光线波长和颗粒大小不同而有所区别。散射浊度法是在入射光的一定角度检测粒子发出的散射光，散射光的强度与复合物的含量呈正比，即待测抗原越多，形成复合物越多，散射光强度越强。又可分为速率散射比浊法(rate nephelometry)和终点散射比浊法(endpoint nephelometry)。 免疫胶乳比浊法 原理 选择一种大小适中，均匀一致的胶乳颗粒，吸附抗体后，当遇到相应抗原时，则发生凝集，单个胶乳颗粒在入射光波长之内，光线可透过，当两个胶乳凝集时，则使透过光减少。这种减少的程度与胶乳凝集成正比，与抗原量成正比。 （a）带抗体的胶乳在波长之内可透过光线； （b）结合后，则形成光线衰减 方法评价 敏感度高，试剂稳定，因反应液中无PEG沉淀剂的影响，个体IC对结果影响也小，所以结果稳定、可靠，特异性好；不需特殊仪器设备，一般分光光度计、自动化生化分析仪或散射比浊仪均可使用。 总评价 缺点： 测定结果与仪器的性能和试剂的质量密切相关，特别对抗体的质量要求高，仪器和试剂价格比较贵。 优点： ①自动化 ②快速(30～60s) ③灵敏(μg/L) ④准确 ⑤精密度高(CV5％) ⑥稳定性好 ⑦节省试剂 ⑧检测范围广 ⑨不需减去样本和试剂本底值等优点。 免疫比浊测定的影响因素 抗原抗体比例 抗体的质量 抗原抗体反应的溶液 增浊剂的使用 抗原抗体比例 高剂量钩状效应（high dose hook effect ) 海德堡（heidelberger）曲线理论 抗体的质量 （1）特异性高 （2）效价高 （3）亲和力高 （4）抗血清来源 抗原抗体反应的溶液 pH 6.5~8.5 电解质 离子强度、种类（磷酸盐缓冲液） 增浊剂的使用 PEG、tween-20等非离子型亲水剂 作用：消除蛋白质分子周围的电子云和水化层，促进抗原、抗体分子靠近，结合形成大分子复合物。 三、凝胶内沉淀试验(gel phase precipitation) 主要是指琼脂糖扩散或称凝胶扩散(gel diffusion)。常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝胶等。 ★根据实验目的与方法不同，可将固相内沉淀验分为2类： （一）免疫扩散 ①单向免疫扩散试验 (single gel diffusion test) ②双向免疫扩散试验 (double gel diffusion test) （二）凝胶免疫电泳 (gel immuno-electrophoresis) 火箭免疫电泳 对流免疫电泳 （一）单向免疫扩散试验 原理：将一定量的抗体混入琼脂凝胶中，使待测的抗原物质在凝胶中自由扩散，与抗体结合形成沉淀环，沉淀环的大小与抗原浓度呈正相关。 是一种稳定、简便、毋需特殊设备，一般实验室均可使用的常规方法，试验的重复性和线性均好。敏感度为1.25mg/L。 操作步骤 1.将抗体和0.9%琼脂糖50-56℃混合,即刻倾注成平板。 2.待凝固后在琼脂板上打孔,孔中加入已稀释的抗原溶液和不同浓度的抗原标准品溶液。 3.置37℃,让其向四周自由扩散,24-48h后可见其孔周围出现沉淀环。 单向辐射状免疫扩散 上排为5个不同的参考，中、下排为患者血清，下排右2为一异常病理血清 影响因素 1. 抗原分子量 抗原分子量大，扩散慢，沉淀环较小；抗原分子量小，扩散快，沉淀环相对较大。要求待检血清和抗原标准品在血清学上具有均一性，否则可能出现结果偏高或偏低。 2. 抗体种类 实验证明兔抗血清优于马、羊抗血清，兔抗血清可测抗原0.1~1IU/ml，马抗血清为1~10IU/ml，羊为0.4~4IU/ml，为提高实验敏感度，应首选敏感度高的抗血清。 3. 抗体稀释度 抗体浓度大，沉淀环小，则敏感度低；抗体浓度小，沉淀环增大，不同浓度抗原间的差