实验一_九.ppt

生 物 化 学 实 验;一、实验课的目的 1、培养和锻炼科学的思维方法、实事求是的科学态度和严格的科学作风，提高分析、解决问题的能力。 2、通过实验加深对理论课程的理解，学习掌握基本的生物化学实验技能与实验方法，为今后的学习和研究打下一定基础。 3、培养爱护公物、爱护集体、团结互助的优良品德。;1、课前必须预习，写好预习报告。 2、了解实验的基本原理和主要步骤，做到心中有数。 3、上实验课必须穿实验服，带实验讲义。 4、不许大声喧哗，有问题及时请教老师。 5、器材、药品等严格按规定使用，严禁乱用乱放。 6、实验过程中因个人未能按着实验要求操作而导致器材的损坏，按规章制度进行赔偿。 7、遵守实验制度，爱护仪器，注意安全（如，水、电、 煤气、强酸、强碱等）。;8、实验过程要正规操作，动手、动脑主动进行实验；掌握关键，力求得出准确结果；仔细观察，认真思考，及时做好记录；综合分析得出正确的实验结论。 9、因故不能按时上实验者应有请假手续。 10、实验结束后将相关器材要彻底清洗干净，放到指定位置。 11、废弃物严格按要求分类收集、处理。 12、值日生要按规定要求将实验室打扫干净，检查门窗、水、电、煤气等。;三、实验内容;实验一 核酸的比色定量分析 ——紫外分光光度法;掌握紫外分光光度计的基本原理和使用方法 掌握紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法;实验原理：;仪器及耗材： 紫外分光光度计，石英比色皿，离心管。 试剂： 动、植物基因组DNA（RNA）或大肠杆菌质粒DNA（RNA），待测样品DNA（RNA），TE或蒸馏水。;（1）用TE或蒸馏水，将待测样品以1:10或更高倍数稀释。 （2）取2只石英比色杯，加蒸馏水至2/3，在260nm下调零。 （3）取出比色槽外侧的比色杯，去掉蒸馏水，加待测样品 DNA，在260nm、280nm及310nm处读取OD值。 （4）小心取出比色杯，用蒸馏水清洗，将水吸干，放入比色 杯盒内。;（5）计算浓度： 纯DNA或RNA浓度可用下列公式计算： [dSDNA]=50×(OD260-OD310)× 稀释倍数（?g /ml） [SSDNA]=33×(OD260-OD310)×稀释倍数（?g /ml） [SSRNA]=40×(OD260-OD310)× 稀释倍数（?g /ml）;注意事项： OD310值是背景，若盐浓度高， OD310值也高。 OD260/OD280 对DNA而言其值约为1.8，高于1.8 可能有RNA污染，低于1.8 可能有蛋白质污染。 OD260/OD280 对RNA而言其值约为2.0; 蛋白质和核苷酸等也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处，在260nm处的吸收值仅为核酸的1/10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小，RNA的260nm与280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260nm与280nm吸收的比值则在1.8左右。 当样品中含有蛋白质、苯酚等杂质，则A260/A280比值下降，应设法去除。;实验一 蛋白质的比色定量分析 ;1．采用紫外光吸收法测定样品的核酸含量，有何优点及缺点？ 2．若样品中含有核苷酸类杂质，应如何校正？ 3. 地衣酚显色法（RNA）和二苯胺显色法的缺点是什么？;实验二 蛋白质的比色定量分析 ——考马斯亮蓝法;实验目的 熟悉分光光度计的基本原理和使用方法 掌握利用考马斯亮蓝定量分析蛋白质的方法; 考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态呈红褐色，当它与蛋白质结合后变为蓝色，前者最大吸收波长为488nm，后者为595nm。在一定蛋白浓度范围内（0.01~1.0mg/ml），蛋白质-色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量分析。蛋白质和考马斯亮蓝G-250结合2min左右达到平衡，完全反应十分迅速，其结合物在室温下1小时内保持稳定。该反应非常灵敏，可测微克(?g)级蛋白质含量，所以是一种常用的蛋白质快速测定法。;实验器材 ;Coomassie brilliant blue G-250 ;主要试剂;取6支10ml干净试管 按下表取样，混匀，放置2min。在?595nm 下比色，纪录数据。以OD值为纵坐标、标准蛋白含量为横坐标作图，得到标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的OD值，即可查出未知样品的蛋白含量。; 操作步骤同上;制备待测样品：称取新鲜绿豆芽2g 放入研钵，加2mL 蒸馏水研磨成匀浆，转移到离心管