第二章 基因工程制药(三).ppt

第二章 基因工程制药 离子交换介质的选择原则 离子交换介质的选择原则 离子交换层析的基本操作 层析柱平衡 平衡缓冲液的用量至少为柱体积的2倍。 平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速。 平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、pH值与缓冲液一致为准，其中pH值最重要。 样品进柱 为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质交换量的10～20％，为了避免进样溶液中离子强度过高，样品浓度不宜太高。 交换容量：离子交换剂中全部可交换的离子或功能集团的总数。 离子交换层析需注意的问题 离子交换层析的应用 20种氨基酸中大部分带正电或负电，这是IEC应用范围广的原因。 IEC处理量大，附载系数高，一步缩小样品体积很多。 IEC去除杂质能力强，如对热原、核酸、外毒素等。 利用蛋白质在不同pH和盐浓度下带电性的不同，分两步IEC使目标蛋白达到提纯目的。 IEC原则上讲可放在纯化工艺的任何一步，它属于吸附层析，单步损失也较大。 亲和层析（Affinity Chromatography，AC） 亲和层析是利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附，如抗体与抗原、受体与激素、酶与底物之间的作用。 亲和层析 配基：在亲和层析中起可逆性结合的特异性物质。 载体：与配基结合的支撑物。 亲和层析大体可分三步： 　　　配基固定化 　　　吸附目的物 　　　样品解吸 亲和层析的特点 AC具有分离纯化目标单一，回收率高的特点。从理论上讲，AC得到的是相当纯的产物，这种分离能力是其它任何柱层析都难以相比的。 AC柱制作工艺复杂，同时在色谱洗脱过程中配体不可避免的脱落，不但柱子的寿命有限，而且必须经特别处理才能注射或服用，因此成本比较昂贵，一般不放在纯化工艺的前面。 凝胶过滤（Gel Filtration Chromatography）? 凝胶过滤是以具有大小一定的多孔性凝胶作为分离介质，小分子能进入孔内，在柱中缓慢移动，而大分子不能进入孔内，快速移动，利用这种移动差别可使大分子与小分子分开。 凝胶过滤 根据蛋白质的相对分子量和蛋白质分子的动力学体积的大小差异，可以利用凝胶过滤来分离纯化目的蛋白。 主要应用两个方面： 脱盐和更换缓冲液 蛋白质分子的分级分离。 　在产品的形成阶段前用于除去产物的多聚体及降解产物。 疏水层析（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC） 以蛋白质疏水性为分离基础。 通过表面疏水性差异分离蛋白质。 疏水键的形成对于非极性基双方无特异性要求，不同蛋白质表面及内部疏水区的多少、大小、强弱、分布及空间位阻效应各不相同，这也是HIC分离蛋白质的根本所在。 在20种氨基酸中有8种是疏水性氨基酸，其强弱为：色氨酸（Trp）、异亮氨酸（ILe）、苯丙氨酸（Phe）、脯氨酸(Pro)、缬氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、蛋氨酸（Met）、丙氨酸（Ala）。 影响HIC的因素 HIC的应用 非蛋白质杂质的去除 主要包括： DNA、热原质和病毒的纯化方法。 DNA的去除：DNA在pH4.0以上呈阴离子，蛋白质的pI在6.0以上,可用阴离子交换剂吸附除去。 如蛋白质为强酸性，可选择条件使其吸附在阳离子交换剂上，而DNA不吸附。 亲和层析和疏水层析也有效。 非蛋白质杂质的去除 热原质的去除：热原质是肠杆菌科产生的细菌内毒素（脂多糖）去除困难。分子量小的多肽或蛋白质中的热原可用超滤或反渗透，脂多糖是阴离子可用阴离子交换层析除去，脂多糖是疏水性可用疏水层析法。 病毒的去除：层析或过滤可将病毒去除。 浓缩、干燥和保存 蛋白质的浓缩： 减压加温蒸发浓缩 空气流动蒸发浓缩 冷冻法 吸收法 超滤法 沉淀法 浓缩、干燥和保存 浓缩、干燥和保存 十、基因工程药物的质量控制 基因工程药物的特点：用活细胞作为表达体系，所获得的蛋白质产品往往相对分子量较大，并有复杂的结构，许多药物是参与一些生理功能精密调节所必需的蛋白质，所以任何药物在性质或剂量上的偏差，都可能造成严重的后果，从原料开始每一步都要进行严格的控制。 基因工程药物的质量控制 宿主细胞中表达的外源基因，在转录翻译精制工艺放大过程中都可能发生变化，故从原料以及制备全过程都必须严格控制条件和鉴定质量。 原料的质量控制 原料的质量控制是为了保证编码药品的DNA 序列的正确性，以及产品质量的安全性和一致性。 明确目的基因的来源、克隆经过，并以限制性内切酶酶切图谱和核苷酸序列予以确证； 应提供表达载体的名称、结构、遗传特性及各组