三．制药微生物菌种的保藏.pptVIP

第二章 微生物发酵制药技术  发酵工程是一门具有悠久历史，又融合了现代科学的技术，是现代生物技术的组成部分。 第一节 微生物发酵概论 两千多年前，用豆腐上生长的霉治疗疮。 汉书记载用丹曲治疗赤白痢下等症。 宋真宗年代，利用人痘防天花，1796年英国琴纳利用牛痘防天花。 1857年巴斯德提出著名发酵理论：“一 切发酵过程都是微生物作用的结果。” 1874年robert观察到灰绿青霉生长培养基不易染菌，1876年报道霉菌溶解细菌。 1877年提出微生物拮抗 1885年cantani利用变形杆菌菌悬液治疗结核病。 1899年emmerich和low分离得到绿脓菌酶治疗白喉。 1923年法国研究出卡介苗。 1924年从放线菌中发现白放线菌素。 1929年Flemming爵士发现了青霉素，增加一大类新产品-抗生素。 20世纪40年代，以获取细菌的次生代谢产物-抗生素为主要特征的抗生素工业成为微生物发酵工业技术的支柱产业。 20世纪50年代，氨基酸发酵工业又成为微生物技术产业的又一个成员，实现了对微生物的代谢进行人工调节，这又使微生物技术进了一步。 20世纪60年代，微生物技术产业又增加了酶制剂工业这一成员。 20世纪70年代，为了解决由于人迅速增长而带来的粮食短缺问题，进行了非碳水化合物代替碳水化合物的发酵，如利用石油化工原料进行发酵生产，培养单细胞蛋白，进行污水处理，能源开发等。 80年代以来，随着重组DNA技术的发展，可以按人类社会的需要，定向培养出有用的菌株，这为微生物发酵技术引入了遗传工程的技术，使微生物技术进入了一个新的阶段。 目前，人们把利用微生物在有氧或无氧状态下生命活动来制备微生物菌体或其它代谢产物的过程统称为发酵。 二、微生物发酵制药研究的内容 微生物发酵制药是利用微生物进行药物研究、生产和制剂的综合性技术科学。 研究内容包括：微生物制药用菌的选育、发酵以及产品的分离和纯化工艺等。 主要讨论用于药物发酵的各种微生物来源和改造、微生物药物的生物合成和调控机制、发酵工艺与主要参数的确定药物发酵过程的优化控制、质量控制等。 1.微生物菌体发酵 是以获得具有某种用途的菌体为目的的发酵。用于面包制作的酵母发酵及用于人类或动物食品的微生物菌体蛋白发酵是比较传统的菌体发酵工业。新的菌体发酵可用来生产药用真菌，如香菇菌、依赖虫蛹而生存的冬虫夏草菌、与天麻共存的密环菌等药用菌。 2.微生物酶发酵 酶普遍存在于动物、植物和微生物中。因为微生物种类多、产酶的品种多、生产容易和成本低等特点，所以目前工业应用的酶大多来自微生物发酵。 3.微生物代谢产物发酵 微生物代谢产物很多。在菌体对数生长期所产生的产物，如氨基酸、核苷酸、蛋白质和糖类等是菌体生长繁殖所必需的，这些产物叫做初级代谢产物。在菌体生长静止期，某些菌体能合成一些具有特定功能的产物，如抗生素、生物碱、植物生长因子等。这些产物与菌体生长繁殖无明显关系，叫做次级代谢产物。 4.微生物的转化发酵 微生物的转化是利用微生物细胞的一种或多种酶，把一种化合物转变成结构相关的更有经济价值的产物。可进行的转化反应包括：脱氢反应、氧化反应、脱水反应、缩合反应、氨化反应、脱氨反应等。 5.生物工程细胞的发酵 是指利用生物工程技术所获得的细胞，如DNA重组的“工程菌”，细胞融合所得的“杂交”细胞等进行培养的新型发酵。此类发酵的产物多种多样，如用基因工程菌生产胰岛素、干扰素等。 第二节 制药微生物与产物的生物合成 利用工业微生物发酵生产过程中，决定生产水平高低最主要的因素有三个： 生产菌种 发酵工艺 后提取工艺 一、制药微生物的选择 1.样品的采集与处理(土壤、海洋) 2.分离方法（稀释法、膜分离法） 3.活性测定（琼脂扩散法) 自然选育的具体步骤 1、单孢子悬浮液的制备 2、分离及单菌落培养 3、筛选（初筛、复筛） （二）．诱变育种 1、制定筛选目标 高产 生长速度快 消除色素或无益成分 能有效利用廉价发酵材料 改善发酵中的某些缺陷 2、制定筛选方案 （1）诱变过程： 出发菌种斜面 单孢子悬浮液制备 孢子计数 单菌落分离 （2）筛选过程 传种斜面 留种保藏菌种 筛选高产菌株 利用物理因素（如ⅹ射线、γ射线、紫外线、激光等） 化学因素（如亚硝酸、硫酸二乙酯等）来处理生物，使生物发生基因突变。 生物诱变 病毒（Rous肉瘤病毒） 在物理诱变剂中，尤以紫外线为最方便，而在化学诱变剂中，一般可选用诱变效果最为显著的“超诱变剂”，如NTG。（亚硝基胍） 几种常用菌种保藏方法的比较 (一)斜面低温法 把培养好的斜面菌种放在4~6℃冰箱中处保存，定期移植，一般1～3个月移植