细菌内毒素检查技术-毕特博.ppt

2007-9-10 Bitab 细菌内毒素检查技术讲 义 北京毕特博生物技术有限责任公司 2007年9月 目 录 一、细菌内毒素检查的基础理论-------------3 二、 BET试验前的准备------------------------24 三、细菌内毒素检查的实验技术-------------28 1，鲎试剂灵敏度复核-------------------------33 2，干扰初筛试验------------------------------40 3，干扰试验------------------------------------49 4，检查法---------------------------------------62 四、细菌内毒素检测技术的发展 一、细菌内毒素检查的基础理论 1，细菌内毒素 2，鲎试剂 3，BET用水 4，BET程序 5，2005年版细菌内毒素检查法 6，相关参数的计算 7，试验的相关知识 1、细菌内毒素1）化学成分及特性 -- 革兰氏阴性细菌细胞壁的产物 -- 是高分子量脂多糖复合物（LPS）    除上述性质外，LPS还有许多其他的生物活性 2） 内毒素与热原的关系 -- 内毒素是热原之一种-- 医药工业接受的观点是，内毒素是目前医药工业中最普遍和最主要的外源性热原，控制内毒素污染就等于控制热原污染。 3）标准内毒素和环境内毒素1）标准内毒素 经人工提取精制并经生物效价测定的细菌内毒素，作为BET检查的参考品或对照品。主要分参考标准品（RSE）及工作标准品（CSE）。CSE的效价必须用RSE来标化。目前CSE的效价有两种标示方法：固定效价法（中国）及浮动效价法（国际）。2）环境内毒素 天然产生的内毒素，普遍存在于水、空气及各种原料中，成分除了脂多糖外还含有较多的蛋白质、多糖和其他杂质，其极性不明显，致热性较标准内毒素弱。BET的对象是环境内毒素。 4）标准内毒素溶液（C溶液）的制备 1）中国药典2005年版的BET法规定，将细菌内毒素国家标准品用细菌内毒素检查用水溶解后，需在旋涡混合器上混匀15分钟，以后每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟，其他国家药典都有类似要求 -- 具有极性的内毒素分子在水中呈现不均匀分布 2、鲎试剂 1）鲎试剂的分类 -- 根据鲎的种类分类 美洲鲎试剂(LAL) 中国鲎试剂或东方鲎试剂（TAL） -- 根据检查方法分类 凝胶法鲎试剂 光度法鲎试剂 -- 根据鲎试剂的反应特异性分类 普通鲎试剂 特异型鲎试剂 2）鲎试剂的规格 -- 一般分单次试验试剂和多次试验试剂（也称大装量试剂） -- 把自身的包装容器作为反应管的试剂称为单次试验试剂，在国内使用的0.1ml/支的鲎试剂就属于单次试验试剂 -- 多次试验试剂有0.5ml/支、1.2ml/支等，使用时应先用相应量的溶解液复溶鲎试剂。 3）鲎试剂的质量标准 -- 灵敏度 定义：再细菌内毒素检查法规定的条件下，能使鲎试剂产生凝集的标准内毒素的最低浓度，单位EU/ml。 常用鲎试剂的灵敏度：0.5EU/ml、 0.25EU/ml、 0.125EU/ml、 0.06EU/ml、0.03EU/ml -- 自身凝集 部颁标准，鲎试剂的阴性对照在37度4小时不产生凝集反应 -- 缓冲能力 -- 干燥失重 -- 无菌：中国标准无此项要求 4）鲎试剂与内毒素的反应机理 3、BET用水 2000年版药典要求，BET用水应为与0.03EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂在37±1℃条件下24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。 2005年版药典要求，凝胶法BET用水应为内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水；光度测定法用的BET用水内毒素含量应少于0.005EU/ml。 美国药典要求的BET用水是指与所使用的鲎试剂不发生反应的灭菌注射用水或其他水。 4、BET程序 1）验证实验 凝胶法 光度测定法 2）检查法 凝胶法 光度测定法 动态法 终点法：终点比色法试验 5、《中国药典》2005年版细菌内毒素检查法 1）综述部分 细菌内毒素检查法的定义及BET方法学分类 内毒素标准品及检查用水 BET器具的要求 供试品溶液的要求 内毒素限值的确定 最大有效稀释倍数的计算 2）试验部分 （1）凝胶法 鲎试剂灵敏度复核试验 干扰试验 检查法 （2）光度测定法 标准曲线的可靠性试验 干扰试验 检查法 1）内毒