五dna的琼脂糖凝胶电泳一.ppt

实验五 DNA的琼脂糖凝胶电泳 一、实验原理 DNA分子在pH值高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向阳极移动。 DNA分子在电场中通过琼脂糖凝胶而泳动，除了电荷效应以外，还有分子筛效应。由于DNA分子可片段的相对分子质量不同，移动速度也不同，所以可将相对分子质量不同或构象不同的DNA分离。 0.6~1.4%琼脂糖凝胶适用于3*106~11*106相对分子质量的DNA分子或片段的分离，所需DNA样品量为0.5~1.0ug。 琼脂糖凝胶电泳分离后的DNA可用溴化乙啶染色。 溴化乙啶分子可插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间，形成一种荧光络合物。在254nm波长紫外光照射下，呈现橙黄色的荧光。用溴化乙啶检测DNA，可检出10-9g以上的DNA含量。 二、试剂与材料 1、琼脂糖： 1g 溶于缓冲液中加热配成100ml。 2、pH8.3,Tris-硼酸-EDTA缓冲液：称取10.78gTris，5.50g硼酸，0.93g EDTA-Na2溶于无离子水，定容至1000ml 每组250 ml 3、0.05%溴酚蓝-50%甘油溶液：取一定量的0.1%溴酚蓝水溶液，与等体积甘油混合而成。 100ml /班 4、标准DNA溶液； DNA经限制性核酸内切酶EcoRI水解，生成的6个DNA片段，其分子量分别为：13.7*106, 4.74* 106 , 3.73* 106 ,3.48 * 106 ,3.02* 106 2.13* 106 。 5、0.5ug/ml溴化乙啶染色液，称取5mg溴乙啶，用无离子水溶解，定容至100ml。从中取1ml，用无离子水稀释，定容至100ml。（有毒，戴手套，在通风柜内进行。） 6、水平板型电泳槽 7、直流稳压电泳仪 8、微量移液枪 9、254nm波长紫外分析仪 10、DNA样品液：DNA经某种内切酶水解后，得到相对分子质量不同的小片段。 三、操作方法 琼脂糖胶液的制备：称取1 g 琼脂糖，置于三角烧瓶中，加入100mlpH8.3Tris-硼酸-EDTA缓冲液，瓶口扣上一小烧杯，加热8-10分钟，琼脂全部融化于缓冲液中。取出摇匀，即为1%琼脂。（也可加溴化乙啶2.5ul） 凝胶板的制备 用橡皮膏将凝胶塑料托盘短边缺口封住，置水平玻板或工作台面上（须调水平，将样品槽模板（梳子）插进托盆长边上的凹槽内，距一端约1.5cm）。梳子底边与托盘表面保持0.5一1mm的间隙。待琼脂糖冷至65℃左右。取25mL小心地倒入托盘内，使凝胶缓慢地展开直至在托盘表面形成一层约3mm厚均匀胶层。液内不存有气泡。室温下静置0.5－lh。 待凝固完全后，用小滴管在梳齿附近加人少量缓冲液润湿凝胶，双手均匀用力轻轻拔出样品槽模板（注意勿使样品槽破裂），则在胶板上形成相互隔开的样品槽。 取下封边的橡皮膏。将凝胶连同托盘放人电泳槽平台上。用缓冲液先填满加样槽，防止槽内窝存气泡。接着再倒人大量pH8.3 Tris-硼酸-EDTA缓冲液直至浸没过凝胶面2－3mm。 加样 将酶解后的DNA样品液与溴酚蓝-甘油溶液以4：1的体积比混合，用微量注射器分别加人到凝胶板的加样槽内。每个糟加10ul左右。因此加样量不宜超过20ul，避免因样品过多而溢出，污染邻近样品。加样时，注射器针头穿过缓仲液小心插人加样槽底部，但不要损坏凝胶槽，然后缓慢地将样品推进槽内让其集中沉于槽底部。 电泳 加样完毕，将靠近样品槽一端连接负极，另一端连接正极（千万不要搞错），接通电源，开始电泳。在样品进胶前可用略高电压，防上样品扩散。样品进胶后，应控制电压降不高于5V／cm(电压值V／电泳板两极之间距离比)。当染料条带移动到距离凝胶前沿约lcm时，停止电泳。 染色 将电泳后的胶取出，小心推至0.5ug／ml溴乙锭染色液中，室温下浸泡染色30min。 ? 观察与拍照 小心地取出凝胶置托盘上，并用水轻轻冲洗胶表面的溴化乙锭溶液，然后再将胶板推至预先浸湿并铺在紫外灯观察台上的玻璃纸内，在波长254nm紫外灯下进行观察。DNA存在的位置呈现橘红色荧光，肉眼可观察到清晰的条带．荧光在4-6小时后减弱，因此，初步观察后，应立即拍照记录下电泳图谱．观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩，避免紫外光对眼睛的伤害。 拍照时，照相机加上近