高浓度葡萄糖和高浓度胰岛素对体外培养视网膜Müller细胞胞内[Ca2+]i的影响.docVIP

精品论文 参考文献 高浓度葡萄糖和高浓度胰岛素对体外培养视网膜Müller细胞胞内[Ca2+]i的影响 李芳1 宋鄂2 董宇2 陈雪艺1（1新疆医科大学第一附属医院眼科 830000；2吉林大学第一附属医院眼科 130021） 【中图分类号】R587.1【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2011）39-0019-03 【摘要】目的 探讨高浓度葡萄糖、高浓度胰岛素对体外培养的视网膜Muuml;ller细胞胞内[Ca2+]i的影响。方法 采用荧光探针技术，应用激光共聚焦显微镜动态、定量测定细胞外高钙、钙拮抗剂条件下，正常、高浓度葡萄糖、高浓度胰岛素、高浓度葡萄糖＋高浓度胰岛素培养的视网膜Muuml;ller细胞胞内[Ca2+]i的变化。结果 高浓度葡萄糖、高浓度胰岛素、高浓度葡萄糖＋高浓度胰岛素培养的视网膜Muuml;ller细胞胞内[Ca2+]i明显升高，在细胞外高钙条件下各组[Ca2+]i均降低，在细胞外钙拮抗剂条件下各组[Ca2+]i均再次下降。结论 高浓度葡萄糖和高浓度胰岛素均能使视网膜Muuml;ller细胞胞内[Ca2+]i明显升高，而钙拮抗剂通过干扰细胞外钙离子进入细胞来降低[Ca2+]i。 【关键词】葡萄糖 胰岛素 钙离子 视网膜Muuml;ller细胞 糖尿病视网膜病变 糖尿病视网膜病(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病常见和严重的微血管并发症之一，目前，胰岛素和口服降糖药是治疗糖尿病的主要途径，研究证明DR的神经元的功能丧失和死亡归因于Muuml;ller细胞的反应性变化[1]。视网膜Muuml;ller细胞是一种特化的神经胶质细胞，贯穿视网膜全层，包裹所有的视网膜神经元，维持视网膜的结构和功能，参与视网膜的多种病理生理过程[2]。钙离子广泛存在于细胞内、外液, [Ca2+]i是调节细胞生长和信号传递等生理过程的重要因素，研究发现视网膜内钙离子含量及糖尿病病程高度正相关[3]。因此阐明高浓度葡萄糖和高浓度胰岛素条件下视网膜Muuml;ller细胞[Ca2+]i的变化及其在DR的发病中的作用，将有可能为防治DR提供新的思路。 1 材料与方法 材料 1. 实验动物：健康成年大耳白兔由吉林大学实验动物中心提供，雌雄不限。 2. 主要试剂：DMEM培养液，标准胎牛血清（均为美国Gibco公司产品）；fluo-3荧光染色剂（Biotium公司产品），EDTA（上海生工产品）；维拉帕米（上海九福产品）。 3. 主要仪器设备：CO2恒温培养箱（日本Sanyo公司产品）；激光共聚焦显微镜FV500（日本Olympus公司产品）；倒置生物显微镜（日本Olympus公司产品）；KR-20000T 台式高速离心机（美国Sartouris公司产品）。 方法 1. Muuml;ller细胞的培养及鉴定[4]：采用组织块悬浮法培养视网膜Muuml;ller细胞，3%戊巴比妥钠(1ml/kg体重)，沿兔耳缘静脉注入，待麻醉有效后，无菌操作取出眼球，D-Hankrsquo;s液冲洗3遍，沿锯齿缘后约1mm处环行剖开眼球，去除晶状体和玻璃体，留后半眼球壁置于DMEM培养液中剥离视网膜，轻轻洗掉粘着的色素上皮细胞，将视网膜置于体视显微镜下，去除富含血管及髓放线的部分，将视网膜撕碎成约1mmtimes;1mm小片组织。吸取组织块置于培养瓶中，加足量含15%标准胎牛血清的DMEM培养液，置于5%CO2 孵箱内，37℃下保存（图1，2）。约7天后，组织块贴壁并长出数个细胞，悬浮组织块周边发亮（图3），此时用吸管吹打贴壁的组织块，吸入离心管中离心800r/mintimes;5min，弃上清液，加入培养液重悬沉淀，再移入另一培养瓶中培养，约2周后，细胞从组织块周边爬出并达到80%以上融合，此时可进行消化传代。传代方法如下：将培养瓶内培养液吸出，加入0.25%胰蛋白酶37℃下消化，当细胞周边开始收缩时停止消化，弃胰蛋白酶，用含血清的DMEM培养液轻轻冲洗2遍，加入无血清的DMEM培养液，用吸管吹打，吸入离心管中离心800r/mintimes;5min，弃上清液，加入培养液重悬沉淀，1:2～1:3移入培养瓶中培养。HE染色、GFAP免疫组织化学法（图4-7）及透射电镜法[5] （图8）鉴定视网膜Muuml;ller细胞。 (箭头所示)（2500times;） 2. 实验分组：第2代培养细胞（P2）用于实验。将细胞（细胞计数：7times;105/ml）传代于24孔板中，使细胞均匀分布于各孔，至细胞达到80%融合时，弃掉DMEM培养液，换条件培养液，共分