基因工程论文综述基因打靶技术.doc

基因打靶技术研究概述 （09生物工程 当时不再 中国XX大学XX学院 000000） 摘 要 通过外源DNA序列与靶细胞内染色体上的同源DNA序列间的重组，将外源DNA定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，或对某一预先确定的靶位点进行定点突变，从而改变细胞遗传特性的方法成为基因打靶。本文就基因打靶研究的一般过程包括载体构建、打靶策略、筛选策略，打靶效率，条件打靶以及基因打靶的应用等方面做了比较详细的综述。 关键词 基因打靶 Cre-loxP重组系统 定点整合  基因打靶(gene targeting)技术是20世纪80年代发展起来的一项重要的分子生物学技术，是利用基因转移方法，将外源DNA序列导入靶细胞后，通过外源DNA序列与靶细胞内染色体上的同源DNA序列间的重组，将外源DNA定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，或对某一预先确定的靶位点进行定点突变，从而改变细胞遗传特性的方法[1]。基因打靶技术的发明和应用革命性地改变了现代生物医学研究的面貌，催生了许多生物医学和药物研发领域的前沿研究，并直接导致了生物医学研究领域中的许多突破性进展。基因打靶技术的发明使得科学家第一次能对关于特定基因生理功能的假设进行实验验证，并通过基因打靶研究真正建立基因和疾病间的因果关系[2]。该技术的先驱者美国科学家马里奥·卡佩基(Mario R. Capecchi)、奥利弗·史密斯(Oliver Smithies)和英国科学家马丁·埃文斯(Martin J. Evans)也因此在2007年获得了诺贝尔生物学或医学奖。 1 基因打靶技术的一般过程 1.1 载体构建： 打靶载体通常包含两段与打靶区域两端同源的区域，中间一段不同源且为目的序列，并带有某种药物筛选标记。应用于基因打靶的载体构建策略通常有插入型载体和置换型载体。插入型载体，是指断裂位点位于同源序列内，选择基因紧邻同源目的序 列，载体DNA同源目的序列与染色体靶位点发生一次同源交换。整个载体整合到染色体靶位点上。置换型载体，是指断裂位点位于同源序列的外侧或两侧，选择基因位于同源目的序列内部或外侧，载体DNA同源目的序列与染色体靶位点发生两次同源交换。 如今，应用于转基因细胞制作的载体主要有病毒载体、普通质粒载体及基因打靶载体。其中病毒载体因其高效的感染性受到许多学者的青睐，但病毒载体存在插入位点的不可预测性和承载外源基因长度有限的问题；普通质粒载体虽然有较大的承载量，但存在整合效率低和多拷贝插入的缺陷；而基因打靶载体可对细胞进行单拷贝基因定位修饰，并且能够稳定的遗传。迄今为止用基因打靶的方法已经生产出了转基因牛、羊、鼠。基因打靶技术的关键步骤之一是基因打靶载体的构建。 目前，对于不同的基因打靶位点，需要分别构建打靶载体，包括骨架载体的选择、正负选基因的连接及鉴定、多克隆的设计、同源臂的插入等一系列烦琐的过程，同时，由于酶切位点太少而限制了许多载体的应用。并且现行用基因打靶方法生产的转基因动物基因组中，都整合有正选择标记基因新霉素磷酸转移酶基因neo，neo的存在会影响中靶细胞及转基因动物个体的生长和正常生理状况，同时增加了后期研究工作的影响因素。陈兴启[3]等以克隆载体pEGM-3Z为骨架，在其多克隆位点中插入了1个正选择标记neo、2个负选择标记HSV-tk1和HSV-tk2，并在neo的两侧各添加了一个方向相同的LoxP序列，并且证实这两个LoxP序列存在生物活性，能在打靶成功后用Cre/LoxP系统排除neo干扰。从而构建了载体pA2T，载体中，neo和HSV-tk1之间有8个酶切位点，neo和HSV-tk2之间有5个酶切位点，并且这些酶切位点在基因组中出现的频率较低，可以满足大多数基因座位点构建同源臂插入。 根据核仁组织区重复序列课完全表达的性状，蒋泓[4]等以奶牛(Bos taurus)为研究对象，以其核仁组织区rRNA串连基因(18S、5. 8S和28SrRNA基因)间的间隔序列为靶位点，基于BAC重组酶系统构建出含增强型绿色荧光蛋白基因的通用型奶牛多位点基因打靶载体系统，一定程度上扩大了载体的容量，简化了操作。 1.2 基因打靶策略[5]，[6] 1.2.1 插入型载体策略(O型载体)（图1） 构建的插入型载体包含靶基因的同源区，及选择标记基因(neo)，并且在该同源区内有特异酶切位点，在进行同源重组时在载体同源区内制造一个线性化缺口，同源重组的发生将导致整个载体插入到染色体同源区内，此插入序列能够抑制正常基因的功能。然后用含有G418的培养基进行筛选携有neo基因的克隆，此方法比较简单，但是其最大缺点是不能直接区别和筛选出外源DNA定点整合的细胞克隆和随机插入的细胞克隆，另外两个拷贝的串联重复序列不稳定，可能发生染色体内重