酶学及酶工程课5章-14.pptVIP

酶学及酶工程 Enzymology and Enzyme Engineering 田维熙 教授 中国科学院大学 第五章 酶学新概念:几种特殊形态的酶 一、核酶 Ribozyme 核酶指一类具有酶催化功能的核酸。 核酶的发现打破了酶都是蛋白质的传统概念。 早期发现的核酶都是RNA。 1981年美国科罗拉多大学Cech等发现四膜虫rRNA中I型内含子具有自我剪接功能。1983年Altman等发现一种RNA可催化tRNA前体为成熟tRNA，具有RNase P的活性。 核酶的发现打破了只有蛋白质才可能有酶催化功能的概念。为此获得1989年度诺贝尔奖。 核酶的催化类型 核酶分为催化分子内反应和分子间反应二大类。催化分子内反应核酶又可分为自我剪接（Self-splicing）和自我剪切（Self-cleavage）二类。 已发现的RNA核酶有几十种。其中的植物病毒、拟病毒、卫星RNA均为以RNA为模板，以滚动环方式复制的RAN，自我切割是其RNA生命周期中不可缺少的一环。 内含子的自我剪接 四膜虫26S rRNA转录产物可在几秒钟内自动切除413nt的内含子。 游离G亲核攻击内含子剪接点，切开后外显子接在一起。内含子切除19nt后可自身环化，还可形成能分子间催化的核酶。 分子间催化反应 锤头状二级结构 锤头状二级结构中有13个核苷酸保守序列，其中11个不变时剪切反应即可发生。 核酶的应用前景 1）作为高特异性RNA限制性内切酶； 2）作为抗病因子：根据特定生物来源的靶RNA序列为底物设计Ribozyme，合成其序列，进行克隆或转入体内表达，可用于抑制靶RNA，实现抗病。这也为艾滋病治疗提供了可能的新途径。 3）生命起源探索。 发现脱氧核酶 1997年Joyce等获得两种具有催化活性的DNA。这使酶的概念进一步扩大。这种有酶活性的DNA称为脱氧核酶。 把锤头核酶转换为DNA，合理变化后可以得到有催化活性的锤头脱氧核酶。锤头脱氧核酶的体外转录物中发现有锤头核酶活性。这种核酶和脱氧核酶的相互转换可能对生命起源有重要的意义。 “酶分子环”假说 因此人们在关注核酶是否能翻译出有活性的酶。目前已有初步结果发现这是可能的，并称这种酶为“肽酶”。 有科学家提出“酶分子环”假说，提出在生命起源的早期，存在的是均具有催化活性的脱氧核酶、核酶和肽酶，它们可以相互衍生组成酶分子环。在循环往复的进化过程中逐渐演化成主要由DNA携带遗传信息，由蛋白质实现催化生化反应的格局。 二、抗体酶 Abzyme 1986年Lemer和Schultz分别在Science上发表了具有酶催化功能的抗体的研究报告，称为Abzyme。抗体酶基质为免疫球蛋白，在易变区具有酶的功能。 根据诱导契合理论，酶与过渡态互补，是酶催化机理之一。酶和抗体的不同在于酶结合过渡态，抗体结合的是基态。如果抗体能结合过渡态，就可能有催化能力。 抗体酶的制备 引入法 将催化基因引入已有底物结合能力的抗体的抗原结合位点上。 1）用定点突变技术将特定氨基酸引入抗原结合部位。 2）用选择性化学修饰方法将催化基团引入抗原结合部位。 应用的条件是事先对抗体结构要有所了解。 诱导法 以过渡态类似物为半抗原，和载体（如牛血清白蛋白）偶联，再用单克隆技术制备、分离、筛选抗体酶。 例：诱导法产生磷酸酯水解抗体酶 磷酸二酯键是最稳定的键之一。Janda等用稳定的五配位氧代铼络合物模拟RNA水解时的环形氧代正膦中间物，产生抗体酶催化水解磷酸二酯键。 发展前景 理论研究：验证过渡态和过渡态理论。 应用：可能按特定需要设计及制造新的“酶”，如专一性分解病毒特有蛋白的抗体酶可能成为抗特定病毒的药物。 一些天然酶不能催化的反应，可能研制特定抗体酶进行催化。 抗体酶和固定化技术等结合可能有广泛酶工程应用前景。 尚需解决的问题 1）催化效率目前比天然酶低2-3个数量级。大多数抗体酶尚未达到实用阶段。 2）抗体酶筛选是通过与半抗原结合力大小进行的，而不是根据催化活性。但二者并不是完全相同的。 3）底（产）物抑制。底物、产物结构与过渡态类似时会有强的底（产）物抑制。 三、模拟酶（enzyme mimics） 模拟酶：比天然酶结构简单但具有酶催化活性的非蛋白质的人工合成酶。 酶的模拟工作经历的三个层次： 1）合成有一定酶活性的简单络合物； 2）模拟活性中心； 3）酶的整体模拟：以模拟酶活性部位空间结构为基础，连接上特定的催化集团。 目前常用的模拟酶：环糊精模拟酶和冠醚模拟酶。 1. 环糊精模拟酶 环糊精：6-8个D（+）葡萄糖，通过1，4糖苷键首尾连接成环状。全部为无变形椅式构象。 环糊精 无还原端，不被淀粉酶水解。 醇羟基位于洞穴外边缘，具亲水性，洞穴内壁为氢和糖甙链氧，有疏水性。 一定