微生物知识概况及污染菌库建立-陈莹.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 谢 谢！ JUST DO IT！ 92/92 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 革兰氏阴性菌 革兰氏阳性菌 60/92 革兰氏阳性球菌： 产品样本、水、环境监测中发现的大多数阳性球菌来自人，有些可能来源于天然来源的原料。 药品生产中包括无菌工艺，最常见的污染物是革兰氏阳性球菌，有葡萄球菌属、微球菌属、链球菌属。 人源污染的细菌经常与不规范的无菌行为和操作、裸露的皮肤或头发(人类脱落)有关。 常见革兰氏菌污染来源 61/92 革兰氏阳性杆菌 污染物通常来自于环境，特别是土壤或尘埃，也会来自原料，如聚乙二醇(PEG)。 生物工艺最常见的革兰氏阳性杆菌污染，是芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属，它们产生的内生芽孢对环境压力有高耐受性。 芽孢杆菌属污染与缺乏无菌操作意识，材料和表面的消毒不彻底，无效SIP循环，违反无菌原则，以及污染的原料有关。 常见革兰氏菌污染来源 62/92 革兰氏阴性杆菌 污染通常来自水源、土壤、植被、原料。 革兰氏阴性杆菌包括大肠杆菌属，假单胞菌属，伯霍尔德杆菌属，劳尔氏菌属、狭长平胞属等。 事实上， 水和液体系统中通常发现存在这些属的微生物污染。 所以，在生物工艺操作样品中通常不会发现革兰氏阴性杆菌。产品污染革兰氏阴性杆菌经常与积水、设备的清洁维护保养护操作不彻底相关。革兰氏阴性菌污染的主要问题之一是内毒素 常见革兰氏菌污染来源 63/92 革兰氏阴性球菌 在医学上是与人类有关的。 它们包括引起性传播疾病(淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌)和呼吸道感染(卡他莫拉菌)的微生物。 这类的污染很少出现在生物工艺中。 如果结果显示有革兰氏阴性球菌污染，很有可能是检验错误。 常见革兰氏菌污染来源 64/92 革兰氏阴性螺旋菌 在制药用水系统或洁净室环境很少发现。 这些细菌与排泄物污染有关,包括被污染的水源。 当检测到该类菌时，应该全面调查找到它的潜在来源。 常见革兰氏菌污染来源 65/92 分离纯化得到单菌落 菌落形态检验 DNA提取 构建系统发育树 分子生物学鉴定 通用引物扩增细菌16S rDNA 序列 16S rDNA序列分析 鉴定结论 样品接收 革兰氏染色 形态鉴定 生理生化鉴定 细菌鉴定仪 细菌的鉴定流程图 66/92 生理生化--半自动细菌鉴定仪（ATB New） 检测项目：可鉴定由环境、原料及制成品分离出的菌种和药敏试验（包括：肠杆菌、非发酵G-杆菌、葡萄球菌、链球菌、酵母菌、厌氧菌）。可鉴定770种细菌和分析近80种抗生素药敏实验。 67/92 分离纯化得到单菌落 菌落形态检验 DNA提取 构建系统发育树 分子生物学鉴定 通用引物扩增细菌16S rDNA 序列 16S rDNA序列分析 鉴定结论 样品接收 革兰氏染色 形态鉴定 生化鉴定 ATB细菌鉴定仪鉴定 细菌的鉴定流程图 68/92 分子生物学--具体流程 基因组的制备 PCR克隆16sRNA 阳性克隆鉴定，测序 同源性分析，系统进化树建立 69/92 系统发育树 根据同源性分析结果和系统发生树来判定该菌株为Cellulophaga属细菌, 命名Cellulophaga sp.QY201。 * 70/92 3、真菌的鉴定 71/92 真菌的鉴定流程图 分离纯化得到真菌样品的单菌落 真菌菌落形态观察 真菌DNA的提取 构建系统发育树 分子生物学评价 通用引物扩增真菌ITS 序列 ITS序列在GenBank中进行Blast分析 鉴定结论 72/92 真菌形态观察 通常把真菌分为酵母菌和丝状真菌(霉菌)。 霉菌由粗大、有隔或无隔分支状菌丝构成，菌丝分为基质菌丝和气生菌丝。气生菌丝特化结构上产生多种无性、有性孢子。孢子着生部位、排列方式以及孢子形态是真菌鉴定的重要依据。 * 73/92 酵母菌 是微小的单细胞真菌。 可能在非专业人员看来，平皿上的酵母菌落像细菌。然而，在显微镜下，这些细胞大得多，看起来像葡萄干，因此可以很容易地区别于细菌。 生物工艺中典型的酵母污染是生物工艺中的人员、植物和原材料。 常见酵母菌污染来源 74/92 霉菌 是多细胞真菌，其产生的细丝称为菌丝。因此其学名为“丝状真菌”。 这类微生物在土壤、尘埃(粉尘)和植被中非常常见。 霉菌污染是这些微生物在生殖周期中会产生的孢子。因此霉菌污染很容易传播。 另一个问题是大多数物种产生的真菌毒素对人类有