酶法转化丙酮酸的研究.docVIP

酶法转化丙酮酸的研究1 谷劲松许平李铁林曲音波 (山东大学微生物技术田末重点实验室济南250l 00) 摘要从土壤样品中言集、筛选和纯化获得了三株能产生乳酸氧化酶的茵株，三株茵中1 0}菌株的产 酶活力最高．谴茵株被选做进一步研究的酶源．本文对10#茵株还进秆了破壁条件的优化、生长曲线的 分析和醇液稳定性研究，井初步探计了其酶液的底物转化效率，4·1、时最高转化率达到80％，谊研究结 果为将选种有价值的畔潭推向生产奠定了基础． 关t胡乳酸氧化肆．丙酮酸，醇法转化 丙酮酸是一种重要的医药、化工产品，许多氨基酸的生物合成都需要以丙酮酸为起始物质． 如：L一二羟基一苯丙氨酸(L-DOPA)作为一种有效的抗癌药物，就是以丙酮酸为底物，在酚基裂解酶 的作用下获得的(NagasRwa，1981)；另外，L一亮氨酸、卜半胱氨酸、L一色氨酸和L一酪氮酸的生产 也都采用丙酮酸为原料(Yonehara，T．et a』．，1994)。除此以外，丙酮酸还是一些农药和植保 产品合成的有效起始物。 国外发酵法制取丙酮酸己有近十年的历史，但是通过微生物发酵的方法生产的丙酮酸往往转 化率较低，这是因为丙酮酸在糖代谢中处于最具活力的中间点，在细胞中很容易转化为其他化合 物．因此根难累积。而且，丙酮酸作为发酵产物混合物的一种成分，往往是相当低浓度的，从复杂 的发酵液中分离提取丙酮酸，一般是难以进行的．费用也较昂贵。 由于发酵法生产丙酮酸存在诸多缺陷。这就使人们想到通过生物酶直接转化底物生成丙酮酸。 这其中最合适的底物就是乳酸，乳酸脱氢酶和乳酸氧化酶都可转化乳酸一步生成丙酮酸，而且乳 酸和丙酮酸的价格相差很大(约20倍)，这就使乳酸酶法生产丙酮酸成为具有活力的研究热点之 一● 近年来世界上有许多专利涉及用酶法生产丙酮酸，乳酸脱氢酶作为一种经典的催化酶．广泛 地存在于各种生物体中，如：动物、酵母、细菌(Gunther et a1．，1987)，脱氢酶催化如下反应， 该反应是可逆反应．反应平衡倾向于乳酸一边：辅酶NAD+为小分子化合物，很难和酶蛋白 Lactate+NAD+=；=====!=Pyruvatc+NADH+H。 ～起固定化，不易再生重复利用，而且价格十分昂贵，这些因素限制了脱氢酶的应用。 德国化学与生物中心的Simon教授课题组(Schinschel，C．et a1．，1993)使用Proteus mir出ilis和Proteus vulgaris作为酶源，细胞内的主要转化酶被称作2R一羟羧酸一紫罗碱一氧化 还原酶(2R-hydroxy—oxidoreduetase，hWOR)．这种酶的特点是不需要NAD+或NADP+作为辅酶， Schinschel用葸醌一2，6一二磺酸(anthraquinone-2，6-disulphonate．AQDS)作为氧化还原的电 子转移中间体，同时用二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)还原酶对AQDS进行再生，巧妙 的解决了小分子中间体再生的问题，取得了良好的效果。生物化学反应式如下所示： ’·田家自然科学基金(批准号：No资助项目． 274  DMS为二甲基硫，它的沸点为38C，在这种情况下，如果把反应体系温度控制在40℃．生成 的DMS就会很快趴反应体系中逸出，这就意味着反应会不断地向丙酮酸生成的方向进行。另外， 由于hWOR的电子传递不需经NAD+和NADF+等一系列的中间体而直接传递给人工氧化还原中间体 (AODS)，氧化还原电位差会增加几百毫伏，反应平衡常数也会相应增加十几倍，从而更加有利于 丙酮酸的生成。209／L(干重)的Proteus mirabilis休止细胞1小时内可转化94％．0．65M的(R) 一乳酸为丙酮酸．对应于14．7mol／1．d．g干菌体(Schinschel，C．et a1．，1993)。 Schinschel使用Proteus mirsbilis的苗体细胞作为酶源，该菌体含有一定数量的丙酮酸甲 酸裂解酶，为了避免生成的丙酮酸被丙酮酸甲酸裂解酶降解，根据这种酶的檄活机理，将反应必 需的Fe2+与低浓度的EDTA混合加入，可以稳定反应系统中的丙酮酸。这种方法虽然由于电子转移 中间体的循环使用而大大降低了生产成本．但由于所用酶源仍是脱氢酶．本身所带的局限性没有 解决，最终产物丙酮酸与辅酶的分离存在困难．AQDS价格也很高。 昂贵的电子受体限制了乳酸脱氢酶的应用，这就使人们把目光投向乳酸氧化酶，细菌细胞内 乳酸氧化酶催化的生化反应式为： CH3CH20HCOOH+02——4 CH3COCOOH+H202 乳酸氧化酶作为一种黄素蛋白，是以F)／，N或FAD作为辅因子，其电子转移的形式不同于经典 的电子传递链，而是直接以氧作底物，FMN或FAD和酶