猪肉制品中含火鸡肉成分之定量检验.DOCVIP

食品中動物性成分檢驗方法－豬肉製品中含火雞肉成分之定量檢驗 101年3月1日署授食字第1011900486號公告訂定 1. 適用範圍：本檢驗方法適用於豬肉製品中含有火雞肉成分之定量檢驗。 2. 檢驗方法：檢體經DNA萃取後，以即時聚合酶鏈反應（real-time polymerase chain reaction, real-time PCR）之方法。 2.1. 工作環境：工作平台需寬敞、潔淨、光線良好。檢體前處理、檢體DNA抽取、real-time-PCR試劑配製及real-time-PCR等檢驗過程皆需有區隔空間，避免交叉污染。PCR試劑之配製應於無菌操作台內進行。 2.2. 裝置（註1） 2.2.1. 即時聚合酶鏈反應器：Roche LightCycler? 或同級品。 2.2.2. 冷凍乾燥裝置：溫度可達 -40℃以下，真空度可達133 mBar以下，供檢體乾燥用。 2.2.3. 振盪型粉碎機：Retsch MM200或同級品。 2.2.4. 真空乾燥裝置：供DNA乾燥用。 2.2.5. 高壓滅菌釜。 2.2.6. 無菌操作台。 2.2.7. 加熱振盪器：具溫控及振盪功能。 2.2.8. 微量冷凍離心機（Micro refrigerated centrifuge）：可達20000 × g，並具4℃溫控功能。 2.2.9. 離心機：供各式微量離心管離心用。 2.2.10. 分光光度計：具波長260 nm、280 nm。 2.2.11. 冷凍設備：具冷藏及凍結（-20°C）功能。 2.2.12. 旋渦混合器（Vortex mixer）。 2.2.13. 酸鹼度測定儀（pH meter）。 2.2.14. 水浴裝置：溫差 ±1℃以內者。 2.2.15. 天平：最大稱重量為2000 g，靈敏度為0.1 g；最大稱重量為100 g，靈敏度為1 mg。 註1： 本方法所使用或提及之產品品牌及型號不代表為同類產品中最好者；反之，未使用或未提及之產品品牌及型號亦不代表為同類產品中較差者。 2.3. 試藥 2.3.1. DNA抽取用：RNase A及乙醇（96-100%）均採分子生物分析級試藥；適用於動物DNA抽取之市售套組。 2.3.2. Real-time PCR用（註2） 　2.3.2.1. 定量試驗用引子及探針 　　2.3.2.1.1. 哺乳類、家禽類及魚類（標的基因：12S ribosomal RNA，供作內部對照基因） 　　　　　　　引子F：12SF, 5(- CAAACTgggATTAgATACCCCACTA -3( 　　　　　　　引子R：12SR, 5(- ATCgRTTMTAgAACAggCTCCTCTAg -3( 　　　　　　　探針P：12SP, 5(-(FAM)- CACCgCCAAgTCCTTTgRgTTT TARgC -(TAMRA)-3( 　　　　　　　豬：PCR增幅產物大小154 bp 　　　　　　　火雞：PCR增幅產物大小154 bp 　　2.3.2.1.2. 火雞（標的基因：12S ribosomal RNA） 　　　　　　　引子F：TURF, 5(- CCCTAACCCCTTAAgAAAAgAAT -3( 　　　　　　　引子R：TURR, 5(- gCACAAgATTTACCAACCCTA AA-3( 　　　　　　　探針P：TURP, 5(-(FAM)- TCTAATgTAgCCCAAgACg CCTTgCTTgT-(TAMRA)-3( 　　　　　　　PCR增幅產物大小171 bp 註2：1. 合成之引子與探針，拆封後，以無菌去離子水稀釋成適當濃度，分裝後置於-20℃貯存備用，探針需避光保存。探針5(端採用6-carboxy-fluorescein（FAM）標記，3(端採用6-carboxytetramethyl-rhodamine（TAMRA）標記。 　　?? 2. 內部對照基因引子及探針之序列中，R為混合鹼基代碼（A/G），表示同時含A及G；M為混合鹼基代碼（A/C），表示同時含A及C。 　2.3.2.2. LightCycler? FastStart DNA Master HybProbe（適用於Roche LightCycler?） 　　本試劑內含real-time PCR所需去氧核糖核苷三磷酸、聚合酶等，且內附25 mM氯化鎂溶液，使用時添加引子、探針及待測檢體DNA。 2.3.3. 對照用物質：豬肉及火雞肉。 2.4. 器具及材料（註3） 2.4.1. 吸管（Pipette）：10 μL、20 μL、100 μL、200 μL及1000 μL。 2.4.2. 吸管尖頭（Pipette tips）：10 μ