真空冷冻干燥液氮超低温保存砂土管保藏法石蜡油保藏法斜面低温.PPTVIP

项目九 菌种保藏技术 背景知识 菌种保藏的目的与任务 目的： ①保证菌种存活率； ②减少菌种变异，防止优良性状丢失； ③避免杂菌污染。 菌种保藏： 把自然界分离到的野生型或经仍选育的用于科研和生产的优良菌种、菌株，加以妥善保管，使之达到不死、不衰、不变异、不污染以及便于研究、交换和使用的目的。 国内外菌种保藏机构： 中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM) 美国的典型菌种保藏中心(ATCC) 英国国家典型菌种保藏所（NCTC） 法国里昂巴斯德研究所（IPL） (一)传代保藏法 (二)载体保藏法 (三)矿油保藏 (四)冷冻真空干燥法 (五)液氮超低温保存  1 传代低温法 把培养好的斜面或半固体菌种放在4~6℃冰箱中处保存，定期移植，一般1～3个月移植一次(视菌种特征而定)。也可以用穿刺培养，定期移植法保藏细菌。 缺点： 保藏时间短（3个月到半年） 即容易发生遗传变异； 连续传代可使一些生产性状丢失或减弱，也易于污染杂菌。 一些贵重菌株及生产优良菌株不宜用此法保藏。 优点：简单易行 2、载体保藏法 砂土保藏 土壤保藏 滤纸保藏 麸皮保藏 (1)沙土管保藏 微生物生长需要水分，干燥法是使菌处于干燥条件下停止生长及处于休眠状态，达到较长期保藏的目的。此法用于细菌芽孢或产分生孢子的菌种，是现在抗生素发酵工业生产中较常用的菌种保藏方法。 方法 1) 砂土的制备 2）菌种准备 3）埋砂土管 4）保藏 也可将真菌分生孢子用接种环从斜面直接挑取放入沙土中。然后将沙土管抽真空干燥。这时管内砂土松散，表明已干燥。将干燥的砂土管放置在干燥器或密闭容器内、干燥器下部放置变色硅胶等干燥剂，于4℃下保存。 在沙土保藏初期，菌死亡率高，以后逐渐减慢，存活下来的孢子在以后保存期间稳定性较好。用沙土管保藏的某些抗生素产生菌保藏期可达18年(土霉素和链霉素产生菌)到22年(新霉素产生菌)，但对利福霉素、卡那霉素、四环素等容易产生变异的菌种，就不适合作长期的沙土管保存。 （2）土壤保藏法 用土壤代替河沙 适合保藏土壤细菌、放线菌、丝状真菌 保藏时间为2-6年 （3）滤纸保藏法 微生物细胞或孢子吸附在滤纸上干燥后保藏 适合：细菌 酵母菌 丝状真菌 （4）麸皮保藏 麸皮经高压蒸汽灭菌，后接入菌种，生长良好后干燥，低温保藏。 适合：根霉 青霉 曲霉等 3、矿油低温保藏法 本方法的原理是在长好的斜面菌上覆盖灭菌的液体石蜡，达到菌体与空气隔绝，使菌处于生长和代谢停止状态，同时石蜡油还防止水分蒸发，在低温下达到较长期的保藏菌种的目的。保藏温度要求在-4～4℃下。 具体操作是：菌种为斜面培养菌种，斜面不宜过长；选择纯净优质石蜡油，置三角烧瓶中经过121℃高压蒸汽灭菌1～2h，将其放烘箱中(160℃左右)干热处理，去除灭菌时渗入的水分，待石蜡油变得清澈透明后冷却即可加入斜面，斜面上不能出现气泡，液蜡添加量以高出斜面顶部约1cm左右为宜。 缺点：液体石蜡法不适用于所有的菌种。另外可能需多次移种. 优点：方法简便、保藏期比单纯斜面低温保藏期长。 4 真空冷冻干燥法 真空冷冻干燥保藏法是兼具低温、干燥、除氧三方面菌种保藏的主要因素。 对病毒、细菌、放线菌、酵母等大多数微生物都适用 冷冻干燥保存的菌种存活时间长、效果好，一般菌种可保存5年以上，有的可保藏15年以上不发生变异。 还具有体积小、不易污染、便于运输等优点，是一种用得最为广泛的菌种保藏方法。 (1)保护剂的选择及制备（脱脂牛奶或马血清） (2)菌种准备及分装（菌种为纯种，菌龄以稳 定期为好，孢子是新鲜的。 ） (3)制备菌悬液 (4)预冻 即放在-30～ - 40℃下冻结20～ 60min。 (5)干燥 干燥箱温度控制在-30℃以下，并尽快使真度达到66Pa以下。 (5)熔封 (5)检验保藏 注意事项 真空冷冻干燥法 为了防止在冷冻和水分升华过程中对细胞的损害，要采用保护剂来制备菌悬液，使保护剂起到保护和稳定细胞膜的作用。 保护剂的种类：脱脂牛奶、马血清或混合保护剂 (1)保护剂的选择及制备 一些对热敏感的保护剂如血清等用过滤除菌，牛奶、葡萄糖及乳糖等要控制灭菌温度。一般情况下，多数菌种可以用脱脂乳糖等要控制灭菌温度。一般情况下，多数菌种可以用脱脂乳为保护剂。 真空冷冻干燥法 (2)菌种准备及分装 菌种要求为生长良好的纯种，菌龄以处于稳定期为好，孢子是新鲜的。每支长好的斜面加2～3ml保护剂，用接种环将菌苔轻轻刮起(注意勿刮起培养基)，制成菌悬液。 如用液体培养的菌种，则需经离心收集和用灭菌生理盐水洗涤细胞，收集的菌体用保护剂悬浮制成