传统生化制药存在的问题幻灯片.ppt

传统生化制药存在的问题 A、材料来源困难或制造技术问题而无法付诸应用； B、从动物脏器中提取出来，也因造价太高，或因来源困难而供不应求； C、由于免疫抗原等缘故，使它们在使用上受到限制。 基因工程技术的特点 能够十分方便有效地生产许多以往难以大量获取的生物活性物质，甚至可以创造出自然界中不存在的全新物质。;第三章 基因工程制药 教学目标：掌握基因工程制备生物药物的基本原理、基本技术。 教学要求：了解基因工程的概念、基本操作过程和主要用途；理解基因工程制药的特点和基因工程药物主要种类；掌握基因工程药物生产的基本过程，掌握生物药物目的基因的获得方法，掌握药物目的基因的表达方法，掌握基因工程菌的发酵方法及重组蛋白的分离纯化方法。 教学重点：生物药物目的基因的获得方法、药物目的基因的表达策略、基因工程菌的稳定性及重组药物的分离纯化。 教学难点：逆转录法获得药物目的基因、高水平表达策略、产物表达形式的选择、重组药物的分离纯化。 ;Contents of chapter 3;一、重组DNA技术的理论基础 19世纪中 孟德尔 豌豆杂交试验 遗传因子 经典遗传学 20世纪初 摩尔根 果蝇杂交实验 基因 基因学 1944年 艾弗瑞 肺炎双球菌转化实验 遗传物质DNA 分子遗传学 1953年 沃森--克瑞克 DNA双螺旋结构 分子生物学 1973年 伯格--杰克森--考恩--鲍耶 DNA分子体外拼接 基因工程 ;二、重组DNA技术的基本定义 将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。 供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。;三、重组DNA技术的操作过程 ;四、基因工程的基本定义与用途 基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建技术（即重组DNA技术）；而下游技术则指基因工程菌或??胞的大规模培养技术及目的基因产物的分离纯化技术。;基因工程的基本用途 分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源。 设计、构建生物的新性状甚至新物种。 大规模生产生物活性物质。 ;五、基因工程药物的主要种类 1、免疫性蛋白：如各种抗原和单克隆抗体； 2、细胞因子：如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激因子、表皮生长因子、凝血因子； 3、激素：如胰岛素、生长激素、心钠素； 4、酶类：如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂、超氧化物歧化酶。 ;六、基因工程药物生产基本过程 获得目的基因 构建重组质粒 构建基因工程菌（或细胞） 培养工程菌 产物分离、纯化 产品加工、检验等 ;3.2生物药物目的基因的获得 ;TTTTTT;2、cDNA第一链的合成：一次好的逆转录反应可使oligo(dT)选出的mRNA有5-30%被拷贝。 3、cDNA第二链的合成： 4、cDNA cloning：expression vector pUC 5、将重组体导入host cell 6、cDNA library identification 7、目的cDNA 克隆的分离和鉴定 （限制酶图谱的绘制、杂交分析、基因定位、基因测序、确定基因的转录方向、起始点等。） ;二）反转录人工合成互补DNA;三）以大肠杆菌为宿主菌进行基因的克隆; pUC118质粒的多克隆位点整合在lacZ基因中，该位点如果没有插入外源目的基因，lacZ基因便可表达出?半乳糖苷酶，如果平板培养基中含有IPTG和X-gal，X-gal便会被?半乳糖苷酶水解成兰色，大肠杆菌形成蓝色克隆。 在多克隆位点插入外源目的基因，破坏了lacZ基因的结构，大肠杆菌形成白色的克隆;一般克隆基因的检查和鉴定方法;32P标记的DNA分子探针 杂交 放射自显影法;四）IFN-目的基因的获得 1、hIFNα、β的基因都位于第9号染色体；氨基酸组成有29％以上的同源性；结构和功能相似，结合同一种受体，临床作用也彼此接近。 2、IFN Y的基因位于第12号染色体，主要作用是参与免疫调节，并与IFNα、β有协同作用。 ;α-IFN的cDNA 克隆（参阅：P73） 1、人脐血白细胞诱生，制备 mRNA和12s mRNA ； 2、12s mRNA 反转录合成IFN sscD