[生物学]色谱法基本原理.pptVIP

色谱法引论 第一节 概述 色谱法早在1903年由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用。 他在研究植物叶的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。这种方法因此得名为色谱法。以后此法逐渐应用于无色物质的分离，“色谱”二字虽已失去原来的含义，但仍被人们沿用至今。 （二）基线 在实验操作条件下，色谱柱后没有样品组分流出时的流出曲线称为基线，稳定的基线应该是一条水平直线。 （三）峰高 色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以（h）表示。 第二节 色谱流出曲线及有关术语 （四）保留值 1. 死时间t0 不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，它正比于色谱柱的空隙体积，如下图。 第二节 色谱流出曲线及有关术语 （四）保留值 3. 调整保留时间tr′ 某组分的保留时间扣除死时间后，称为该组分的调整保留时间，即 : tr′= tr ? t0 由于组分在色谱柱中的保留时间tr包含了组分随流动相通过柱子所须的时间和组分在固定相中滞留所须的时间，所以tr实际上是组分在固定相中保留的总时间。 第二节 色谱流出曲线及有关术语 （四）保留值 保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组分的保留时间常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积来表示保留值。 第二节 色谱流出曲线及有关术语 4. 死体积V0 指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和。当后两相很小可忽略不计时，死体积可由死时间与色谱柱出口的载气流速Fco（cm3·min-1）计算。 V0 = t0Fco 式中 Fco为扣除饱和水蒸气压并经温度校正的流速。 仅适用于气相色谱，不适用于液相色谱。 5. 保留体积Vr 指从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。保留时间与保留体积关系： Vr= tr Fco 第二节 色谱流出曲线及有关术语 7. 相对保留值r2,1 某组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比，称为相对保留值。 r2,1= tr2 ? / tr1′= Vr2? / Vr1? 由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它在色谱法中，特别是在气相色谱法中，广泛用作定性的依据。 第二节 色谱流出曲线及有关术语 在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（s），然后再求其它峰（i）对这个峰的相对保留值，此时可用符号?表示，即 ? = tr ?(i) / tr ? (s) 式中tr ?(i)为后出峰的调整保留时间，所以?总是大于1的。相对保留值往往可作为衡量固定相选择性的指标，又称选择因子。 第二节 色谱流出曲线及有关术语 (五) 区域宽度 色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一，用于衡量柱效率及反映色谱操作条件的动力学因素。表示色谱峰区域宽度通常有三种方法。 第二节 色谱流出曲线及有关术语 1. 标准偏差? 即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半。 2. 半峰宽W1/2 即峰高一半处对应的峰宽。它与标准偏差的关系为 W1/2=2.354? 3. 峰底宽度W 即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上截距间的距 离。它与标准偏差?的关系是 W = 4 ? 第三节 色谱法基本原理 分配系数是由组分和固定相的热力学性质决定的，它是每一个溶质的特征值，它仅与两个变量有关：固定相和温度。与两相体积、柱管的特性以及所使用的仪器无关。 第三节 色谱法基本原理 k值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此又称分配容量或容量因子。它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。k值也决定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。