[医学]蛋白质的一级结构.ppt

多肽链中AA残基按一定顺序排列：氨基酸顺序 含游离?-氨基的一端：氨基端或N-端 含游离?-羧基的一端：羧基端或C-端 AA顺序是从N-端开始以C-端氨基酸残基为终点 如上述五肽：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln （一）、肽和肽键的结构 ①肽键中C-N键有部分 双键性质 ——不能自由旋转 ②组成肽键原子处于 同一平面（肽平面） ③有一定键长键角 ④大多数情况以反式 结构存在 （三）、 天然存在的重要多肽 前提 1.样品必需纯（97%以上） 2.知道蛋白质的分子量 3.知道蛋白质由几个亚基组成 （一）、蛋白质测序策略 (1) 测定蛋白质分子中多肽链的数目 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。 （一）、蛋白质测序策略 (2) 多肽链的拆分 （一）、蛋白质测序策略 几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体。 可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基)。 （一）、蛋白质测序策略 (3) 断开二硫键 在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的?-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，防止重新被氧化。 （一）、蛋白质测序策略 （一）、蛋白质测序策略 (5)分析多肽链的N-末端和C-末端 (6)多肽链断裂成多个肽段 采用两/多种不同的断裂方法将多肽 断裂成两套或多套肽段，并将其分离。 （一）、蛋白质测序策略 (7)测定每个肽段的氨基酸顺序 （一）、蛋白质测序策略 (9)确定原多肽链中二硫键的位置。 （二）、末端氨基酸残基测定 两类多肽链末端氨基酸残基： N-端氨基酸 C-端氨基酸 在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。 （二）、N末端氨基酸残基的鉴定 ? 二硝基氟苯（DNFB）法：Sanger法 ?苯异硫氰酸酯（PITC)法: ?酶解法：氨肽酶法、羧肽酶法 肼解法： （三）、二硫键的断裂 盐酸胍/尿素解离多肽链间的非共价力。 应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。 1、酶解法: 内切酶：胰蛋白酶、糜蛋白酶、 胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶 外切酶：羧肽酶和氨肽酶 R1=Lys（K）和Arg（R） 专一性较强，水解速度快 R2=Pro（抑制） 2、化学裂解法 ①溴化氰水解法(Cyanogen bromide) ——选择性地切割由Met羧基形成的肽键。 用过甲酸断开二硫键，含有-S-S-的肽段带电性质发生变化，转向90℃二次电泳，曾含二硫键的肽段迁移率发生变化 然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置 蛋白质序列数据库 多肽链的选择性降解 （四）、多肽链的部分裂解和 肽段混合物的分离纯化 肽链 水解位点 胰蛋白酶trypsin （五）、多肽链的部分裂解和 肽段混合物的分离纯化 多肽链的选择性降解 ②NH2OH断裂： 较专一性断裂Asn-Gly之间的肽键 Asn-Leu及Asn-Ala键也能部分断裂 3、肽段的分离纯化： 凝胶过滤、凝胶电泳和 N-端分析法特点：能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。 Edman法 （六）、肽段氨基酸序列的测定 （苯异硫氰酸酯法） Edman于1950年首先提出。 （七）、二硫键位置的确定 第3节 蛋白质的一级结构 蛋白质与多肽无严格的界线 ——通常将6000Dr以上的多肽称为蛋白质。 蛋白质分子量变化范围很大 蛋白质——月示——胨——多肽——肽——AA 1*104 5*103 2*103 1000 200 100 -500 蛋白质构象和结构的组织层次 蛋白质的结构层次 一级结构 二级结构 超二级结构 结构域 三级结构 四级结构 高级结构 空间构象 组织蛋白酶 木瓜蛋白酶 一、肽（peptide） AA-NH2与另一AA-COOH间失水形成的酰胺键 称肽键，所形成的化合物称肽。 由两个AA组成的肽称为二肽。 由多个AA组成的肽则称为多肽。 组成多肽的AA单元称为氨基酸残基。 共价主链 （二）、肽的物理化学性质 等电点（两性）。 酸碱性质取决于： —α-羧基、α-氨基、侧链基团的解离 具有双缩脲反应——Pr特