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HRM建议标准优化流程 LC480 吴春旭 HRM建议标准优化流程 LC480 HRM master mix（原装HRM试剂盒） Touch down PCR / 触底PCR 低引物浓度 优化Mg++浓度 纯合子突变考虑野生型DNA的适当掺入 核酸纯化环节 HRM优化路线路 LC480 HRM master mix 原有PCR体系： Takara hotstart taq酶+EvaGreen Takara hotstart taq酶PCR扩增性能较好，有较为理想的扩增效率与定量PCR扩增曲线 保真性能不如pfu，hotstart效果一般 Takara hotstart taq酶 假设每1kb引入1个错配，PCR产物200bp，一个taq酶每5个循环引入1个错配 错配发生在第1个和第5个循环的概率相同，但对HRM的结果干扰差异很大 Hostart效果一般导致预实验效果理想，但大批量实验效果很差 大批量实验需要加样时间较长 Takara hotstart taq酶 国产taq酶常见问题： 是否完全去除宿主核酸酶与宿主DNA污染？ 配制好后一般不能放置超过1~2小时 保真度或扩增性能不高 对各种干扰因素的耐受能力有限 产品的稳定性可靠性 LC480 HRM Master mix 完善的生产纯化制备与质控流程，GMP品质 更好的PCR扩增性能与保真度 饱和染料ResoLight，耐受淬灭且荧光强度高 Mg离子单独包装，满足不同CG含量的序列扩增需要 LC480 HRM Master mix PCR扩增性能新鲜DNA样品与老DNA样品 LC480 HRM Master mix PCR扩增性能新鲜DNA样品与老DNA样品扩增曲线 新鲜DNA 样品 老DNA样品 LC480 HRM Master mix PCR扩增性能新鲜DNA样品与老DNA样品 Ct范围与浓度范围基本相同 新鲜DNA样品 老DNA样品 LC480 HRM Master Mix 3种基因型，每个32复孔，结果完全一致 LC480 HRM Master Mix20/10/5ul反应体系灵敏度30% 20/10ul杂合 5 ul杂合 LC480 HRM Master Mix20/10/5ul反应体系灵敏度15% LC480 HRM Master Mix 10ul或20ul体系都可以，所有体系按比例配制即可 以李壹的体系为例 LC480 HRM Master Mix10ul体系 注意该处调为10 Touch down PCR / 触底PCR 免于退火温度的摸索 避免引物二聚体与非特异性扩增的出现 设计引物预期Tm+3度作为起始退火温度，每个循环降低0.5或1度，直至53度 Touch down PCR / 触底PCR循环数增加到50~55cycles Touch down PCR / 触底PCR工作原理 高退火温度时，PCR扩增的特异性好，但效率低 低退火温度时，PCR扩增的效率高，但特异性低 前面几个循环先保证PCR扩增特异性，优先合成较多特异性PCR产物 后面的循环由于特异性模板增多，降低退火温度也有较好特异性 低引物浓度推荐0.2uM，建议0.1~0.3uM 低引物浓度，避免引物二聚体与非特异性扩增 对Mg++浓度等因素的抗干扰能力更强 PCR扩增需要更多循环数，建议50~55cycles 低引物浓度高、低引物浓度条件下的熔解曲线比较 16号DNA 0.5ul引物 0.2ul引物 低引物浓度高、低引物浓度条件下的熔解曲线比较 93号DNA 0.5ul引物 0.2ul引物 低引物浓度高、低引物浓度条件下的熔解曲线比较 95号DNA 0.5ul引物 0.2ul引物