实验八 病毒的鸡胚培养.pptVIP

实验八 病毒的鸡胚培养 [目的要求] 1、掌握鸡胚不同途径的接种方法。 2、掌握鸡胚收毒的方法。 3、了解鸡胚培养病毒的用途及优缺点。 4、了解种蛋选择与孵化的注意事项。 鸡胚接种培养病毒是病毒学的重要方法之一，来自禽类的病毒均可在鸡胚中繁殖，来自哺乳动物的病毒如蓝舌病病毒、流感病毒等也可在鸡胚中繁殖。 [鸡胚培养病毒的用途] 用于分离、培养、保存和鉴定病毒，制备病毒抗原、生产疫苗、进行中和试验、观察两种病毒之间的干扰现象等。 [鸡胚培养病毒的优缺点] 优点：①鸡胚内部条件与动物机体相似，病毒易繁殖，能大量产生病毒，在短时间内能获得试验结果。②正常鸡胚一般很少带菌、带毒，而且对接种的病毒不产生抗体。③鸡胚来源充足，经济，易管理，操作简便。 缺点：①有的鸡胚含有母源抗体，能影响实验结果。②有些病原体能通过感染的鸡传递给鸡胚，如沙门氏菌等。③除了产生痘斑的病毒以及引起鸡胚死亡的病毒外，通常不产生特征性的变化，必须用第二个实验系统来检测病毒的存在。 [种蛋的选择与孵化] ①应选健康无病鸡群或SPF鸡群的新鲜受精蛋。 最好5d以内的。 ②鸡群应对所接种的病毒无免疫力。 ③为便于照蛋观察，白壳蛋为好。 ④孵化前以新洁尔灭将鸡蛋外壳擦洗净、晾干。 ⑤用孵卵箱或温箱孵化。温度37.5～38℃、最低 36℃，最高39℃；相对湿度为45～60％，湿度 大小可通过观察气室来判断（湿度大，气室变 小；湿度小，气室变大）。 ⑥每日通气、翻蛋最少2次，翻蛋前要洗手，以免 手上的油脂堵塞气孔使鸡胚死亡。 ⑦孵化开始时将鸡胚横放，在接种前2d立放，大 头向上，注意鸡胚位置，如胚胎偏在一边易死 亡。 ⑧孵化3～4d，可用照蛋器观察，检出未受精卵 和死胚。正常鸡胚——血管分枝明显，呈鲜红 色，鸡胚可以活动。死胚——胚体固定在一端 不动，看不到血管或血管消散。未受精卵—— 灯下仅见卵黄黑影，无胚体、无血管。 [实验材料] 1、9～11日龄鸡胚。 2、新城疫Ⅱ系或Ⅳ系弱毒苗。 3、孵化箱、1mL注射器、蛋架、照蛋器等。 [方法与步骤] 一、病毒的鸡胚接种 1、接种前的准备 ①材料处理 液体材料，加双抗（青霉素100～500IU、链霉素100～500μg）置室温中1h或冰箱12～24h，或经滤器滤过除菌。组织脏器材料，应剪碎、研磨、离心取上清液，必要时加抗生素处理或滤过。 ②照蛋 以铅笔划出气室、胚胎的位置，若要作卵黄囊接种或血管注射，还要划出相应的部位。 鸡胚结构示意图 2、鸡胚的接种 ①尿囊腔接种 取9～11日龄鸡胚，用锥子在酒精灯火焰烧灼消毒后，在气室顶端蛋壳消毒处钻一小孔；针头从小孔处插入，深1.5cm，即已穿过了外壳膜且距胚胎有半指距离，注射量约0.1～0.2ml。注射后以石蜡封闭小孔，置孵育箱中直立孵育。 ②卵黄囊接种 取6～8日龄鸡胚，可从气室顶侧接种（针头插入3～3.5cm），因胚胎及卵黄囊位置已定，也可从侧面钻孔，将针头插入卵黄囊接种。侧面接种不易伤及鸡胚，但针头拔出后部分接种液有时会外溢，需用酒精棉球擦去。其余同屎囊腔内注射。 鸡胚不同部位接种示意图 卵黄囊接种 羊膜腔接种 ③尿囊膜接种 取9～11日龄鸡胚，先在照蛋灯下划出气室位置，并在尿囊膜接种部位作一“记号”。将胚蛋横卧于蛋座上， “记号”朝上。用碘酒消毒记号处及气室部，在气室部位钻一小孔。然后用锥子在记号处蛋壳上轻轻敲一小孔，勿伤壳膜，并用小镊子剥离蛋壳，使孔扩大。用洗耳球吸去气室部的空气，随即因上面小孔进入空气而绒尿膜陷下形成一个人工气室，天然气室消失。用注射器从上面小孔注入0.1～0.2ml病料于尿囊膜上。接种完毕用熔化石蜡封闭两孔。人工气室向上，横卧于孵化箱中，逐日观察。 ④羊膜腔接种 取10～12日龄鸡胚，从气室处或绒尿膜发育区去蛋壳开窗，从窗口用小镊子剥开蛋膜，一手用镊子夹住羊膜腔并向上提，另一手注射0.05～0.1ml病料液入腔内，然后封闭人工窗，使蛋直立孵化，此法可靠，但胚胎易受伤而死，而且易污染。 3、接种后检查 接种后24h内死亡的鸡胚，系由于接种时鸡胚受损或其他原因而死亡，应该弃去，24h后，每天照蛋2次，如发现鸡胚死亡立即放入冰箱，于一定时间内不能致死的鸡胚亦放入冰箱冻死。死亡的鸡胚置冰箱中1～2h即可取出收取材料并检查鸡胚病变。 二、鸡胚材料的收获 原则上接种什么部位，收获什么部位。 1、尿囊腔接种通常收取尿囊液，用无菌法去气室顶壳，并撕去壳膜，撕破尿囊膜，用镊子轻轻按住胚胎，以无菌吸管吸取尿囊液置于无菌试管中，多时可收获5～