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细胞工程抗体——杂交瘤-单克隆抗体 微胞介导的染色体转移 微细胞介导的 染色体转移 二、融合亲本的选择 1.瘤细胞 细胞融合所产生的杂交瘤具有持续合成和分泌两套亲本免疫球蛋白轻、重链的能力，因而可能合成杂合的分子，这些由原先非配对的轻重链所构成的免疫球蛋白分子可能会导致特异抗体效价的下降、减低抗体亲和力、或甚至出现新的特异性。 作为融合亲本的瘤细胞，最好是同种的骨髓瘤或浆细胞瘤系。它们具有发达的内质网，能产生大量所需抗体。 第十章 淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体 §2 B淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体 第十章 淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体 §2 B淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体 二、融合亲本的选择 1.瘤细胞 用于融合的骨髓瘤细胞最好是处于对数生长期；如果是冻存的细胞系，最好在融合前两周复苏细胞，并可用20μg/ml的8-氮鸟嘌呤处理一下，以去除非药敏的回复株。 非分泌型的、具有药敏特性的大鼠、小鼠骨髓瘤系均已建立。 第十章 淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体 §2 B淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体 二、融合亲本的选择 2.抗体生成细胞 高度免疫个体的激活淋巴细胞是B细胞的最佳来源，对大鼠、小鼠等龃齿类动物，这种要求是很容易达到的。 各种组织来源的淋巴细胞，包括脾和淋巴结的淋巴细胞，都曾用于制备有用的杂交瘤。 第十章 淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体 §2 B淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体 三、细胞融合的方法 文献中记载的方法有许多种，应用的融合剂、融合的温度、细胞混合的比例等方面都可能有所不同。 跟我们所采用的方法比较一致，在融合剂作用下融合过程通常只要几分钟就完成了，常用的融合剂是聚乙二醇。 其过程大体如下：将免疫脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞以1:2-1:10的比例混匀，置于50ml尖底离心管内，溶液中不含血清；1200r/min离心7-10min，尽量吸净上清液，以免残液稀释PEG而降低细胞融合率。 第十章 淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体 §2 B淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体 三、细胞融合的方法 用手指轻弹管壁，使管低沉淀的细胞铺展成薄层，在室温条件下边轻轻振摇离心管边在60s内逐滴加入50%PEG 0.5ml；有人将PEG滴管直接插入管底细胞沉淀，边滴边搅拌，5min后边振摇边逐滴加入10ml左右的不含血清的培养液或盐水缓冲液，终止PEG作用。 在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其他可促进生长，这种加入的细胞称为饲养细胞。 第十章 淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体 §2 B淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体 四、杂交细胞的选择 选择的原理：在融合过程中实际上两种细胞相互融合的融合率是很低的，约为1×10-4。为了将杂交瘤或其他作亲本的淋巴瘤系细胞分离出来。 此外，一定要设计一种方法能杀死非融合细胞，否则它们能在体外持续增殖，最终将会超过培养体系中的少数的杂交细胞。 第十章 淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体 §3 单克隆抗体的特性和应用 一、单克隆抗体的特性—亲和力和特异性 单克隆抗体最重要的特性就是它们有明确的特异性，以及它们可以长期提供。单克隆抗体的特异性使它可以鉴定在复杂混合物中少量的抗原，因而在检测系统中非特异的背景非常低。 单克隆抗体是高度抗原特异的，但单克隆抗体也可能有两种方式显示潜在交叉反应，第一种是两种不同抗原但有相同的结构成分。例如对乳酸脱氢酶的单克隆抗体很可能会和异柠檬酸脱氢酶起交叉反应，如果单克隆抗体针对的表位是共有的DNA结合部位；但如果针对的表位是在乳酸结合部位就不交叉。 第十章 淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体 §3 单克隆抗体的特性和应用 一、单克隆抗体的特性—亲和力和特异性 第二种交叉反应是难于检出的，这就是一种单克隆抗体能结合两种或两种以上完全不同的抗原，这可能是由于使用CDRs中的不同氨基酸所致，虽然从构型来说一般不太可能同时能结合两种抗原。 具有这种性质的抗体常是对任何抗原亲和力都很低的IgM类抗体，所以应尽可能避免使用这些抗体。一般说来好的单克隆抗体应该对抗原有高亲和力。 第十章 淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体 §3 单克隆抗体的特性和应用 二、B淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的应用 1.理论研究 A. 构建B淋巴细胞杂交瘤可用于分析B细胞的多样性 B. 利用单克隆抗体可进行表位分析 单克隆抗体突出的优点就是识别复杂抗原结构上的单个表位，也即抗原决定簇，为分析抗原分子的生物大分子复杂结构提供了有力的工具。 第十章 淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体 §3 单克隆抗体的特性和应用 二、B淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的应用 2.诊断试剂中的应用 单克隆抗体现已广泛应用于许多领域的诊断，例如在放射免疫测定、酶联测定中常用的双单抗夹心法，其中针对测试抗