(生物技术制药)2.基因工程制药.ppt

* 中山大学药学院 张革 * 表达形式及信号肽的选择 大多选择分泌表达： 但是信号肽具有选择性，所以选择合适 的信号肽对于提高某种重组蛋白质的表达量是非常重要的。 标准的分泌信号肽a因子和碱性磷酸酶基因PHO1，但在表达某些外源基因中失灵 糖基化：与动物细胞类似 * 中山大学药学院 张革 * 启动子： 醇氧化酶-1（AOX1，AOX2 ）基因的启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一，用甲醇可严格地调控外源基因的表达 常见的表达载体有pPIC3、pPIC9、pHIL-D1、pA0804、pA0815、pPSC3K等，均为整合型载体 * 中山大学药学院 张革 * 毕赤酵母表达系统宿主菌株的表现型 根据对甲醇利用的情况，可将宿主分为3种表型: Mut＋， Muts（slow）， Mut－： 在甲醇培养基中生长速率与野生型类似，称为甲醇利用正表型，即 Mut＋； 当AOX1被其它基因取代，则需依赖AOX2， 其甲醇代谢速度慢，称为甲醇利用慢表型，即Muts。 当AOX基因全部缺失，则不能利用甲醇，成为甲醇利用负表型，即 Mut-。 负表型Mut-为常用菌株。 * 中山大学药学院 张革 * 转化子的拷贝数 拷贝数越高，其产量越高。但存在负效应，会引起细胞生长量的降低 诱导条件 甲醇诱导的时间、浓度、温度的选择. 30° 外源蛋白的降解 选用蛋白酶缺失型宿主菌 * 中山大学药学院 张革 * * 中山大学药学院 张革 * 2.昆虫细胞表达系统 杆状病毒表达系统是目前应用最广的昆虫细胞表达系统，该系统通常采用目宿银纹夜蛾杆状病毒(AcNPV)作为表达载体。Sf9、sf21细胞 昆虫细胞表达系统的优点： 可表达较大的外源基因 可表达不同生物来源的外源基因 与高等生物相似的转录后加工、修饰 杆状病毒具有高度宿主专一性 昆虫细胞表达系统，特别是杆状病毒表达系统由于其操作安全，表达量高，目前与酵母表达系统一样被广泛应用于基因工程的各个领域中。 * 中山大学药学院 张革 * * 中山大学药学院 张革 * 多角蛋白启动子 polyhedrin * 中山大学药学院 张革 * * 中山大学药学院 张革 * * 中山大学药学院 张革 * * 中山大学药学院 张革 * 3.哺乳动物细胞表达系统 由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的外源蛋白质，在活性方面远胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统，更接近于天然蛋白质。 但利用哺乳动物细胞表达系统表达外源蛋白，其产量还不高，难以满足大规模的实际应用。 * 中山大学药学院 张革 * * 中山大学药学院 张革 * * 中山大学药学院 张革 * 将外源基因导入哺乳动物细胞的方法 ： 感染性病毒颗粒感染宿主细胞 通过脂质体法、显微注射法、磷酸钙共沉淀法及DEAE一葡聚糖法等非病毒载体的方式将基因导入到细胞中。 哺乳动物细胞表达系统常用的宿主细胞 CHO、COS、BHK、SP2/0、NIH3T3等，不同的宿主细胞对蛋白表达水平和蛋白质的糖基化有不同的影响，因此在选择宿主细胞时应根据具体情况而定。 * 中山大学药学院 张革 * 二、真核细胞表达制品的安全性的问题 由真核细胞生产的产品可能存在 与肿瘤相关的DNA 病毒DNA尤其是逆转录病毒 我国目前规定：每剂量的药物所含DNA不得大于100pg。 * 中山大学药学院 张革 * * 中山大学药学院 张革 * * 中山大学药学院 张革 * 3.限制性酶谱分析法 将初步筛选的阳性克隆小量培养后，提取重组质粒或重组噬菌体DNA，用1-2种RE酶切，然后进行凝胶电泳，检测插入DNA片段大小。 * 中山大学药学院 张革 * Xho I Not I Xho I MEKK1 1200bp Promoter 400bp pUC-mT 2700bp Colony 1 2 3 1 3100bp 1200bp 400bp 2700bp Xho I cutting Xho I + Not I cutting 1200bp pUC-mT/pLMP1-MEKK1 4300bp 实例 * 中山大学药学院 张革 * 4.DNA序列测定 为了确证目的基因序列的正确性，必须对重组体的DNA进行序列测定。 * 中山大学药学院 张革 * 5.目的基因表达产物测定法 例：免疫斑点测定法 如果表达产物是一种蛋白质或蛋白质的一部分，它具有抗原性可与其特异抗体发生免疫反应。 此法实验操作极似菌落(或噬菌斑)原位杂交。将平板上的克隆转移到滤膜上，处理滤膜使菌体裂解，释放出蛋白质，固定于滤膜上，加入标记抗体。 如果抗体用放射性同位素标记，则免疫反应后进行自显影；若加入的抗体用酶偶联(酶标)，那么此酶就可将无色底物水解成有色产物。 * 中山大学药学院 张革 * 基因载体 目的基因 质粒