二维电泳技术介绍.ppt

二维电泳技术介绍 主要内容 一、蛋白质组学研究意义与面临的困难 二、二维电泳及其重要性 三、二维电泳的方法与存在的问题 四、二维电泳的进展 五、展望 蛋白质组学研究的意义 1、定义： 　　　蛋白质组(proteome) ：一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的蛋白质 　　　蛋白质组学(proteomics)：指研究蛋白质组的技术及这些研究所得到的结果，其内容包括蛋白质鉴定、翻译后修饰、蛋白质功能确定与疾病的关系。 2、意义 　　蛋白质组学是连接基因、蛋白质和疾病的纽带，对蛋白质表达的变化或差异的分析将具有重要的生物学意义和医学应用价值，为阐明生命现象的本质奠定基础。 蛋白质组学研究所面临的困难之一 1、细胞种类的多样性 2、细胞的生命周期 3、蛋白质生成的时效性（30万－300万种） 4、蛋白质的结构与变异 5、研究方法 蛋白质组研究平台 蛋白质组研究平台 蛋白组学的发展依赖于双相电泳技术的发展、电喷雾质谱（ESI-MS）和基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）技术的发明以及在蛋白质分析中的应用和蛋白组信息学的兴起。 二维电泳及其重要性 1、定义：二维电泳是将不同种类的蛋白质按照等电点和分子量差异进行高分辨率的分离分析方法。成功的二维电泳可以将2000到3000种蛋白质进行分离 　①、等电聚焦：电荷 　②、SDS凝胶电泳：分子大小 二维电泳方法与问题 方法的主要步骤： 1、 样品准备 　2、第一维：形成pH梯度进行等电聚焦 　3、第二维：SDS凝胶电泳 　4、染色： 考马氏亮兰或银染 　5、图像分析：肉眼或自动扫描 双向凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同用SDS分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。 等电点聚焦（IEF) 等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，等电聚焦是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。 稳定的pH梯度形成 在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极间逐步建立稳定的pH梯度 蛋白质等电聚焦过程 当蛋白质分子或其他两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终达到一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是该分子的pI，聚焦在等电点的分子也会不断扩散，一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。因此，这些分子总会是处于不断扩散和抗扩散的平衡中，在pI处得以“聚焦” 仪器与试剂 聚丙烯酰胺、甲乙聚丙烯酰胺、两性电解质、尿素、NP-40、triton-100 电极液：1M磷酸（阳极液）、1M氢氧化钠（阴极液） 固定液：100g三氯乙酸、10g磺基水杨酸溶于500ml，定容为1000ml 染色液：0.35g考马斯亮蓝R－250溶于300ml脱色液中，加热到60－70℃，加入0.3g硫酸铜。 脱色液：25％乙醇、8％冰乙酸溶于水 样品缓冲液:1％Ampholine 、2％Triton X-100、9M尿素 样品制备： 用IEF样品缓冲液提取待分析样品，如其他缓冲液提取的样品则应透析后，冷冻干燥、再复溶于IEF样品缓冲液。充分溶解后，离心去除不溶杂质。 配胶： 胶液组成：6ml胶母液（10％）6－8％尿素1ml Ampholine (pH3.5-10)60-80ul 10%AP5 ul TEMED灌胶：配好的胶迅速灌入模具 电泳： 等胶凝固后，小心揭去上下玻璃板，将塑料垫片底部擦干，小心放于电泳槽上。在胶面两边各放一根浸透电极缓冲液的电极条。在胶面上任意位置上放上小擦镜纸片，在纸片上加样，盖上盖子，横功率25W电泳，约10min后，暂停电泳，取下纸片，继续电泳约30min，待电流达4mA以下，停止电泳。 固定：染色：脱色 固定：取出塑料片，放入固定液中15min 染色：取出塑料片放入染色液中65℃染色，直至条带出现 可脱色至背景消除后干燥保存。 注意事项 1、 两性电解质是等电聚焦的关键试剂，它的含量2﹪-3﹪较合适，能形成较好的pH梯度。 2、 丙烯酰胺最好是经过重结晶的。 3、 过硫酸铵一定要新配置。 4、 所有水用重蒸水。 5、 样品必须无离子，否则电泳时样品带可能走歪，拖带或根本不成带。 6、 平板等电聚焦电泳的胶很薄，当电流稳定在8mA，电压上升到550V 以上，由于阴极飘移，造成局部电流过大，胶承受不了而被烧断 目前研究现状 在目前情况下，双向凝胶电泳的一块胶板（16cm×20cm）可分出3～4千个，甚至1万个可检测的蛋白斑点，这与10万个基因可表达的蛋白数目相比还是太少了。80年代开始采用固定化pH梯度胶，克服了