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Chapter 8 荧光免疫技术 （immunofluorescence technique） purpose Master 1.荧光免疫测定的基本原理 2.荧光抗体染色的方法及其原理 3.荧光免疫分析的类型及其原理 Be familiar： 1.荧光的基本知识 2.荧光抗体的制备 Know： 1.荧光物质 2.免疫荧光技术在医学检验中的应用 基本原理 原理： 用荧光素标记Ab或Ag ，与待测标本中相应的 Ag或 Ab结合，通过检测荧光，确定标本中有无相应的Ab或Ag 。 本章内容 荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光技术的敏感性相结合，对抗原或抗体进行定性、定位或定量检测，包括荧光抗体技术和荧光免疫测定。 荧光抗体技术是以荧光素标记抗体,与抗原反应, 在荧光显微镜下观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物，进行定性和定位检测, 分为直接法、间接法和双标记法等。 荧光免疫测定是将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，进行定量测定，分为均相和非均相。 1．概念:荧光、荧光效率、荧光寿命和荧光淬灭 2．常用的荧光物质及荧光免疫技术有哪些？ 3．荧光抗体技术的基本原理是什么？ 4.什么是荧光抗体？如何制备、纯化和鉴定荧光抗体？ 5．荧光抗体染色有哪些方法？各自的反应原理是什么？ 6．荧光免疫测定的基本原理是什么？有哪些方法类型? 7．时间分辨荧光免疫测定的原理是什么？有哪些方法类型? 8．荧光偏振免疫测定的原理是什么？ 9．荧光酶免疫测定的原理是什么？有哪些方法类型? 10．如何评价各种类型的荧光免疫测定？ 11．荧光免疫测定有何应用？ 一、荧光抗体 制备 三、荧光抗体染色及结果判断 Section 3 荧光免疫分析的类型 第三节 荧光免疫分析的类型 2.解离增强 （二）标记物和标记方法 2.标记方法 1－（对苯偶氮）－EDTA 异硫氰酸苯基 －EDTA 异硫氰酸苯甲基 －DTTA （四）方法评价 时间分辨荧光分析系统 1.双抗体夹心法 2.固相抗体竞争法 3.固相抗原竞争法 （一）FPIA原理 （二）方法评价 PTA：三甲基乙酰三氟丙酮 Eu3+元素激发光谱和发射光谱之间的stokes位移 Eu3+ Eu3+在内部的保护性胶体分子团---排斥水分子 “微胶囊” Eu 增强液 激发 Eu 固相Ab 待检Ag Eu标记Ab 每一步均需洗涤 Eu解离发光 增强液 激发 固相Ab Ag？ AgEu3+ 荧光强度 与待检抗原含量 成负相关 增强液 激发 固相Ag Ag？ AbEu3+ 荧光强度 与待检抗原含量 成负相关 定量 (fluorescence polarization immunoassay， FPIA) ?　 二、荧光偏振免疫测定 为一种 均相荧光免疫 测定方法 样品 激发 垂直偏振光 （458nm）蓝色 偏振镜 FPIA分析仪检测 光源 小分子物，旋转快，低荧光偏振 Ag Ab Ag 大分子物，旋转慢，高荧光偏振 偏振荧光 （525~550nm）绿色 发射 （一）FPIA原理 Ag-Ab（多） + AgF-Ab（少） AgF（多） 小分子、旋转快 激发 大分子、旋转慢 激发 竞争 Ab （定量） Ag AgF Ag少 Ag-Ab（少） AgF-Ab（多） Ag多 低偏振值 高偏振值 即待检Ag浓度与偏振荧光强度呈负相关 样品用量少 荧光素标记试剂稳定，使用寿命长 重复性好 快速，易自动化 适于小、中等分子物质检测 灵敏度较非均相荧光免疫测定法低 （一）基本原理 荧光酶免疫测定荧光物质产生示意图 碱性磷酸酶标记抗体或抗原，固相载体包被抗原或抗体，酶分解4-MUP，脱磷酸根基团形成4-MU，360nm激发光照射，发出450nm荧光。 三、荧光酶免疫测定 fluorescence enzyme immunoassay，FEIA （二）酶和荧光底物 荧光酶免疫测定标记用酶及荧光底物 10 450 360 4-MU 4-MUP 碱性磷酸酶 0.03 414 317 二聚体 HPA 辣根过氧化物酶 10 450 360 4-MU 4-MUG β-半乳糖苷酶 相应信号 荧光(nm) 激发光(nm) 荧光产物 底物 标记酶 三、荧光酶免疫测定 （三）方法类型 双抗体夹心法 双抗原夹心法 固相抗原竞争法 参照时间分辨荧光免疫测定 三、荧光酶免疫测定 ＋ ＋ 固相抗体 待检抗原 ALP 标记抗体 ＋ 洗涤除去 荧光激发 4－MUP fluorescence enzyme