斑点杂交测乙肝病毒核酸教材_课件.pptVIP

myszjpwd-myxr-xm 斑点杂交测乙肝病毒核酸 引言 许多乙肝患者正遭受着慢性疾病的折磨,他们可能未曾意识到乙肝病毒还会传染给家人。一方面,实现乙肝疫苗预防接种可大大减少乙肝病毒的感染,另一方面只有通过早诊断、早治疗才能减少乙肝病毒载量,从而降低乙肝病毒的数量。这样不仅保护了患者的自身,还保护了他的家人。 乙肝病毒DNA就是指脱氧核糖核酸,世界上任何生物都是依靠自身的DNA来复制后代的,乙肝病毒也是一样。HBV DNA侵犯人的肝细胞后,控制从复制、装备到释放病毒的全过程,HBV DNA阳性说明体内有活性病毒的复制。HBV DNA高复制就意味病情的稳定性可能比较差,传染性比较高。对HBV DNA的检测同时又有一个监测的意义。对HBV DNA的检测一般有两种, 一种是定性检测,就是阳性或阴性;再就是病毒在体内的病毒载量,病毒载量的高低决定了病毒复制的高低,也就是病毒在体内浓度的高低。病毒载量高可能传染性就大,引起肝脏波动的可能性就比较大。乙肝病毒DNA ,在乙肝的病程中还是起到了一个主要的作用,没它也就没有乙肝了。目前医学界普遍认为抗病毒治疗是治疗乙肝的关键,所以说,检测乙肝病毒DNA对之后的抗病毒治疗以及判定预后效果都很关键。 一 实验原理 具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下(适宜的温度和离子强度等)可按碱基互补的原则退火形成双链,此杂交过程是高度特异的. 本实验杂交双方是待测核酸序列和探针,探针是已知的核酸片断(根据Gene Bank公布的HBV序列,选择集保守性和可变性为一体的前C区作为核酸杂交探针),用地高辛标记,以利于随后的检测,待测核酸是从临床乙肝疑似病人血清中提取的DNA标本. 二 实验材料 1标本 疑似乙肝病人血清中提取的DNA. 阴性对照血清中提取的DNA. 2杂交试剂: 20×SSC 预杂交液. 杂交液 BufferⅠ BufferⅡ BufferⅢ (Roche公司提供) 杂交试剂组成: (1) 20×SSC:3M NaCl(175g/L),0.3M 柠檬酸三钠2H2O(88g/L),用1M HCl 调至PH7.0; (2) 预杂交液:5×SSC,0.5﹪(w/v)封阻 试剂,1﹪(w/v)N-十二烷酰基氨酸 钠,0.02(w/v)SDS; (3) 杂交液:在预杂交液中加入探针,浓度 为2ng/μl; (4) BufferⅠ:100mM Tris-HCl; 150Mm NaCl; pH7.5(20℃) (5) BufferⅡ:0.5﹪(w/v)封阻试剂 配于BufferⅠ中 (6)BufferⅢ:100mM Tris-HCl; 100mM NaCl; 50mM MgCl2; PH9.5(20℃) . 3 2×SSC ;1×SSC ;0.5×SSC 4 抗体 5 显色液 6 显色底物液 7 硝酸纤维素膜 8 微量加样器,培养皿,吸管,烤箱等 三实验方法 1、处理:将硝酸纤维素膜与20xSSC中浸泡1h,夹在两层滤纸中烘烤20～30min 2、变性:将待测DNA样品与100℃水浴10min,立即置冰水中。(使DNA样品变性,即双链DNA→单链DNA) 3、点样:将上述变性后的样品各2～4μl点在硝酸纤维素膜面上,室温下风干后,于烤箱80℃烘烤1～2h(使样品中DNA的与膜结合牢固) 四 实验结果 标本1(浓度低显色慢且浅)和标本2(浓度高显色快且颜色深)显色,标本3与阴性对照不显色,说明标本1和标本2为乙肝病毒阳性,标本3为阴性.