提总DNA操作步骤.docVIP

STE boiling method 试剂： STE：100mM NaCI, 10mM Tris-CI(pH 8.0), 1mM EDTA(pH 8.0) 10mg/ mL蛋白酶K 步骤： 1 细胞离心（2000rpm，10min），去上清； 2 细胞沉淀中加STE（50uL），打散细胞团、混匀，再加蛋白酶K(2uL, 10mg/ml)，摇 匀。95度5min,随后37度处理30min。 3 微量离心。 Characterization of Wolbachia Host Cel lRange via the In Vitro Establishment o fInfections 步骤： 1 106细胞离心（2000rpm，10min），去上清； 2 细胞沉淀中加STE（100uL），打散细胞团、混匀，再加蛋白酶K(2uL, 20mg/ml)，摇 匀。56度处理60min。 Cytological properties of an Aedes albopictus mosquito cell lineinfected with Wolbachia strain wAlbB 步骤： 1 106细胞离心（14000rpm，10min），去上清； 2 细胞沉淀中加200ul 双蒸水溶解，之后加入200ul 20 mM Tris-CI(pH 8.0)，其中含有200mM NaCI，2mM EDTA，1%SDS, 10ug DNAse-free RNAse A。混匀，37度处理1小时，再加蛋白酶K(20ug)，摇匀。56度处理60min。 3 样品95度处理10min ,用酚提取，再用乙醇沉淀。 4 样品重复用70%的乙醇处理，离心，重新溶于0.1ml的双蒸水。 改良CTAB 法 CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖类物质分开。 Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中 β-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除基因组DNA CTAB 核裂解液 CTAB 4g NaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20ml ( PH8.0) 0.5M EDTA 8ml， ,2％PVP(W/V) 先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌 冷却后0.2-1% 2-巯基乙醇（400ul） 氯仿-异戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可 CTAB 核裂解液［100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),50 mmol/L EDTA (pH 8.0)，1.4 mol/L NaCl,2%CTAB(W/V),2％PVP(W/V)］，65 水浴保温60 min。冷却几分钟后加入600 μl氯仿/异戊醇（V/V为24:1），摇匀室温放置5 min，10 000 r/min 离心10 min，重复抽提1次。取上清，加入1/5体积的5 mol/L 的NaCl，加入2/3 体积的预冷异丙醇摇匀，室温放置15 min 后可见白色丝状DNA 沉淀析出。室温离心去上清后加入70% 的乙醇清洗2 次，真空干燥后加入200 μl TE 溶解沉淀，加入RNase A 至终浓度为10 μg/ml，37 水浴保温30 min。加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，10 000 r/min,室温离心10 min，取上清加入1/10 体积的3 mol/L NaAc（pH 5.2）,混匀后再加入2 倍体积的无水乙醇，-20 放置30 min。离心，弃上清，70%的乙醇清洗2次，室温风干后溶于50 μl的TE 中，-20 贮存备用。