蛋白质化学：第四部分.pptVIP

第四部分蛋白质的理化性质与分离纯化 一、蛋白质的理化性质 （一）蛋白质的两性电离： 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。 * 蛋白质的等电点( Isoelectric Point, pI) 当蛋白质溶液处于某一pH环境时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。 在等电点时蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。 盐析(salt precipitation)：将高浓度硫酸铵、硫酸钠或氯化 钠等中性盐加入蛋白质溶液，使蛋白质表面水化膜被破 坏，导致蛋白质沉淀。 分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白 质分段析出。 如：血清球蛋白（50%(NH4)2SO4饱和度）， 清蛋白（饱和(NH4)2SO4)。 3.沉淀类型 A. 可逆沉淀：在某些蛋白质发生沉淀时，蛋白质分子的内部结构并未发生显著变化，基本保持原有的性质，当沉淀因素除去后，能再溶于水溶液，这种作用称为可逆沉淀反应。 大多数蛋白质应用盐析或在低温下应用乙醇（或丙酮）短时间作以及利用等电点进行沉淀反应时，都属于可逆沉淀。 常用于蛋白质的提纯。 B.不可逆沉淀/变性沉淀：发生沉淀反应时，蛋白质分子的内部结构遭到破坏，失去原来的天然性质，沉淀后的蛋白质不能再溶解于原来的溶剂或水溶液中。 重金属盐、生物碱试剂，强酸、强碱、加热、震荡、超声波、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。 蛋白质变性后，由于维持溶液稳定的条件仍然存在而并不 析出，例如：在强酸碱中，变性的蛋白质在强酸碱溶液 中仍存在电荷效应，所以不表现为沉淀现象。 相对地，沉淀的蛋白质也未必都已变性。 即：变性的蛋白质不一定出现沉淀； 沉淀的蛋白质也不一定发生了变性。 3、导致蛋白质变性的因素： 加热、有机溶剂、强酸、强碱、表面活性剂 （如十二烷基硫酸钠即SDS）、还原性试剂 （尿素、盐酸胍）、紫外线、机械力等 。 4、变性蛋白质的性质改变 ① 生物学功能的丧失（主要标志）； ② 分子形状改变，肽链松散，反应基团增加，易被酶消化； ③ 疏水基团外露，水化层被破坏，溶解度降低，易形成沉淀 析出，粘性增加，紫外吸收改变等； ④ 丧失结晶能力。 5、蛋白质的复性： 若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，可缓慢地重新自发折叠成原来的构象，恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(Renaturation) ，这种变性称为可逆变性。 1、根据化学成分测定最小相对分子质量： 利用化学分析定量测定蛋白质中某一特殊元素的含量，并假定 蛋白质分子中含1个这种元素，即可测算最低Mr。 如：用化学分析法测定血红蛋白质中含Fe 0.34％，则 最低 Mr=55.84×100/0.34=16700； 用其它方法测定，其实际Mr为16700的4倍，由此可知，血红 蛋白含有4个Fe的原子，而不是1个 Fe。 2、超离心法： 在60 000～80 000r/min 的高速离心力作用下，蛋白质分子会沿旋转中心向外周方向移动。 超离心法最为准确，但需昂贵的超速离心机。 用光学方法测定界面移动的速度即为蛋白质的离心沉降速度。 蛋白质的沉降速度与分子大小和形状有关，因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。 离心机结构示意图 沉降系数是溶质颗粒在单位离心场中的沉降速度，用S表示。 一个S单位，为1×10-13秒。 相对分子质量越大，S值越大。 蛋白质的沉降系数：1～200S。 超速离心法既可以用来测定蛋白质的分子量也可以用作分离纯化蛋白质。 由沉降系数S可根据斯维得贝格〔Svedberg〕方程计算蛋白质分子的相对分子质量： M=RST/D〔1－iρ〕 R：气体常数 T：绝对温度 D：扩散系数 ρ：溶剂的密度 3、凝胶过滤法 凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状结构。 一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外。 洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来