高效液相色谱培训教案.ppt

盐酸表柔比星 三甲基硅烷柱 注射用盐酸表柔比星 注射用头孢他定 二羟基丙基硅烷键合硅胶柱 度米芬滴丸 苯乙烯-二乙烯基柱 胰激肽原酶 凝胶柱（测纯度） 固定相：极性的有机基团，CN、NH2。双羟基等键合在硅胶表面 流动相：非极性或极性小的溶剂（如正已烷）中加入适量极性溶剂（如氯仿、醇等） 分离机理：范德华力、诱导力或氢键力 用途：多用于分离极性或中等极性化合物 2、正相键合相色谱法（NPBPC） 二、化学键合相色谱法（CBPC） 3、离子键合相色谱法 固定相：硅胶为基质，键合各种离子交换基团，如一SO3H、一CH2NH2、－C00H 流动相：一般采用缓冲溶液。 二、化学键合相色谱法（CBPC） 分离原理：与离子交换色谱类同 用途：多用于分离离子型化合物如酸、无机阴阳离子、氨基酸等 分离原理：物质在固定相上的吸附作用不同 三、液-固吸附色谱法(LSAC) 固定相：吸附活性强弱不等的吸附剂 硅胶、氧化铝、聚酸胶等。 流动相：各种极性的洗脱剂 用途：非极性溶剂中、具有中等相对分子质量且为非离子型的试样。 特别适用于分离异构体 原理：不同待测离子对固定相亲和力的差别 固定相： 基质：合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶 表面键合离子：阳离子和阴离子交换树脂 四、离子交换色谱法（IEC） 流动相：一定pH和盐浓度的缓冲溶液 用途：适用无机离子、有机离子混合物的分离例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。 固定相： 化学惰性的多孔性材料，如聚苯乙烯凝胶、亲水凝胶、无机多孔材料。 流动相： 作用不是为了控制分离，而是为了溶解样品或减小流动相粘度。 五、尺寸排阻色谱法（SEC） 常用流动相 ——四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水 原理：利用被测组分分子大小不同、在固定相上选择性渗透实现分离。 凝胶过滤色谱： 以水或缓冲液作流动相 主要适合于水溶性高分子的分离 凝胶渗透色谱： 以有机溶剂作流动相 主要适合于脂溶性高分子的分离 用途 五、尺寸排阻色谱法（SEC） 特点： 固定相与分子间作用力趋于零，柱寿命长 相对分子质量差别必须大于10％才能分离 第五章 HPLC的建立与应用 一、建立HPLC分析方法的一般步骤 1、根据被分析样品的特性选择适用于样品分析的一种HPLC分离方式。 材料来源、浓度范围 组分特性、结构、分子量、溶解性等  一、建立HPLC分析方法的一般步骤 一、建立HPLC分析方法的一般步骤 2、选择合适的分析方法 适用的色谱柱：柱的规格（柱内径及柱长）和选用固定相（粒径及孔径） 流动相 检测器 样品预处理 一、建立HPLC分析方法的一般步骤 3.分析条件的优化 流动相种类与配比 梯度 温度 流速 检测波长 进样量 一、建立HPLC分析方法的一般步骤 4、由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。 二、HPLC定性定量分析方法 1、定性分析 （1）色谱鉴定法：保留时间对照 各物质在一定色谱条件下均有确定不变的保留时间，因此保留时间可作为定性指标。 应用范围：适用于简单混合物，对该样品已有了解并具有纯物质的情况。 优点：应用简便，不需要其它仪器。 缺点：定性结果的可信度不高。 （2）与其他仪器或化学方法联合定性 混合物经色谱分析后，将各组分直接由接口导入其它仪器中进行定性。常用的联用方法有：LC-FTIR、LC-MS等 其它仪器相当于色谱仪的检测器。 使用范围：复杂样品的定性。 优点：不需要标准物，定性结果可信度高，操作方便。 缺点：需要特殊仪器或设备。 二、HPLC定性定量分析方法 2、定量分析 （1）色谱定量基础 色谱定量分析是基于被测物质的量与峰面积成正比。 （2）定量要解决的问题 峰面积的测量和计算 色谱定量方法及其应用 峰面积的测量和计算 积分仪或色谱工作站 简便、速度快，精度高，可达0.2-2%，对小峰及不对称峰的结果准确，是色谱发展趋势。 手动测量与计算 定量方法 面积归一化法 内标法 外标法 面积归一化法 应用范围：当试样中各组分都能流出色谱柱，且在检测器上均有响应，各组分峰没有重叠时，可用此法。 优点：简便、准确，当操作条件如进样量等变化时，对定量结果影响很小，该法适合于常量物质的定量。 缺点：对该法的苛刻要求限制了它的使用。 内标法 将一定量的纯物质作为内标物，加入到准确称量的试样中。 适用范围：当只需测定试样中某几个组分，且试样中所有组分不能全部出峰时可用。 优点：受操作条件的影响较小，定量结果较准确，使用上不象归一化法那样受限制，此法适合于微量物质的分析。 缺点：每次分析必须准确称量被测物和内标物，不适合于快速分析。 外标法（标准曲线法） 用于常规分析 优点：操作简单，计算方便。 缺点：结果的准确度取决于进样量的重现性和操作条件的稳定性。